铜绿假单胞菌噬菌体PaP2 的结构蛋白及其

第17卷　第4期 医
学研究生学报 Vol.17　No.4
　2004年4月 Journal of Medical Postgraduates
Apr.2004・论 著・
铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其
编码基因的研究
黄建军,　胡晓梅,　朱军民,　申晓冬,　李　明,　饶贤才,　胡福泉
(第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆市微生物工程重点实验室,重庆400038)
摘要:　目的:确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2结构蛋白的构成及其编码基因。

　方法:CsCl 梯度离心纯化噬菌体
PaP2颗粒,SDS 2PAGE 电泳,确定结构蛋白条带及其相对分子质量;然后电转印于PVDF 膜上,用Edman 降解法进行N 端测序。

根据所测的N 端氨基酸残基序列在PaP2预测基因编码的蛋白质中检索,从而逆推其编码基因。

　结果:SDS 2PA GE 显示PaP2含有10条带,其中1、3、4、5、8、9等6条带的含量足以回收进行N 端测序,测得N 端氨基酸残基分别依次为:Met 2Ile 2G lu 2Leu 2G ly 、Ala 2Ile 2Ser 2Pro 、Ala 2Arg 2Phe 2Ile 2Asp 、Ser 2Val 2Tyr 2Ala 2G ly 、Ala 2Ile 2Ser 2Arg 2Asn 2和Ser 2Phe 2Ser 2Leu 2G ly 。

据此推论出它们的编码基因分别是ORF183********、ORF441926419、ORF16589218322、ORF827429530、OrF157********、ORF756328309。

　结论:噬菌体PaP2含有10个结构蛋白,其中6个主要结构蛋白的编码基因分别是orf 24、orf 8、orf 23、orf 12、orf 22、orf 11。

关键词:　铜绿假单胞菌;　噬菌体;　蛋白质N 端测序;　编码基因
中图分类号:　Q939.48 文献标识码:　A 文章编号:　100828199(2004)0420292204
Ξ
The constituent proteins of Pseudomonas aeruginosa phage
PaP 2and their responding coding genes
HUAN G Jian 2jun ,HU Xiao 2mei ,ZHU J un 2min ,SHEN Xiao 2dong ,L I Ming ,HU Fu 2quan
(Depart ment of M icrobiology ,the Thi rd M ilitary Medical U niversity ,M icrobiologic Core L ab of Chongqi ng ,Chongqi ng 400038,Chi na )
Abstract :　Objective :To identify the constituent proteins and their responding coding genes in Pseu 2domonas aerugi nosa phage PaP2.　Met hods :Phage particles of PaP2were purified with the method of CsCl gradient centrifugation.The phage constituent proteins separated by SDS 2PA GE were trans 2ferred to a PVDF filter ,six major bands were excised from the membrane and were subjected to N 2ter 2minal sequence with Edman degradation method.The coding genes of the six proteins could be identified by comparing their N 2terminal sequences with amino acids sequence of the coding sequences of PaP2genome.　Results :PaP2particles are separated to at least eight bands by SDS 2PA GE.The N 2terminal sequences of six proteins are in turn :Met 2Ile 2G lu 2Leu 2G ly ,Ala 2Ile 2Ser 2Pro ,Ala 2Arg 2Phe 2Ile 2Asp ,Ser 2Val 2Tyr 2Ala 2G ly ,Ala 2Ile 2Ser 2Arg 2Asn and Ser 2Phe 2Ser 2Leu 2G ly.Their concluded coding genes are ORF183********,ORF441926419,ORF16589218322,ORF827429530,ORF157********,ORF756328309.　Conclusion :There are ten constituent proteins in PaP2particles.Six corresponding coding genes of them are orf 24,orf 8,orf 23,orf 12,orf 22,orf 11res pectively.Their physical and chemical properties are figured out in this study.K ey w ords :　Pseudomonas aerugi nosa ;　Phage ;　N 2terminal sequencing ;　Coding gene
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292・Ξ
收稿日期:　2003211227基金项目:　2000年度重庆市攻关项目(批准号:6458)作者简介:　黄建军(19692),男,四川岳池人,博士研究生,助理研究员,主要从事噬菌体基因组学研究。

通讯作者:　胡福泉(19532),男,四川珙县人,教授,医学博士,主要从事抗微生物感染及噬菌体基因组学研究。

0　引 言
铜绿假单胞菌噬菌体PaP2是我室自行分离的一株溶原性噬菌体,目前已完成其全基因组测序(基因组为43kb的dsDNA)。

经ORF finder搜索表明基因组中具有154个大于100bp的公开阅读框架(open reading frames,ORF),G eneMark分析提示有51个编码序列(coding sequences,CDS)。

这些预测是生物信息学分析软件的分析结果,需要实验证据来证实;反过来,这些预测结果可以为寻找结构蛋白的编码基因提供帮助。

研究表明,不同噬菌体基因组大小不同,其结构蛋白在数量上差别也较大,多者可达40个以上,少的仅有几个,而且结构蛋白的一级序列差别也非常大,甚至同一宿主菌的不同噬菌体也经常没有任何保守的结构蛋白质1～4。

应用BLAST软件(/)分析噬菌体PaP2,没有检索到与现有蛋白同源的结构蛋白质,故无法确定PaP2的结构蛋白及其编码基因。

本研究首先对纯化的噬菌体PaP2颗粒蛋白作N端测序,根据其在51个预测基因编码的蛋白质中检索结果,确定PaP2结构蛋白的编码基因并分析其特性,为深入研究PaP2打下基础。

1　材料和方法
1.1　铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的纯化　PaP2为本室自行分离鉴定株5。

将PaP2和宿主菌混合液200ml经DNaseⅠ及RNase A消化,除去细菌残渣后,用PEG8000沉淀噬菌体颗粒,用4ml TM液溶解,加在密度分别为1.45g/ml、1.50g/ml、1.70 g/ml的三层CsCl梯度液上,22000r/min离心2h,收集二、三层之间的灰蓝色区带,透析后即得到纯化的PaP2颗粒。

1.2　噬菌体PaP2蛋白的SDS2PA GE　参照《分子克隆实验指南》第二版6,配备12%分离胶和5%积层胶,在PaP2纯化颗粒和中分子量蛋白质标准中分别加入等量2×加样缓冲液,煮沸5min后上样电泳。

30V约40min后换为90V,待溴酚蓝指示剂到达凝胶下缘时,停止电泳。

用考马斯亮蓝R2250染色观察。

1.3　PaP2蛋白转印PVDF膜　参照网站http:// www.expasy.ch/ch2d/protocols/protocols.fm8. html/提供方法。

将平衡好的PVDF膜、Whatman 滤纸和SDS2PA GE后切去积层胶的凝胶制备三明治夹层,由正极到负极依次为:三层Whatman滤纸、PVDF膜、稍小于PVDF膜的凝胶块、稍小于凝胶块的三层Whatman滤纸,4℃恒压30V电转印过夜。

取出PVDF膜染色、脱色。

1.4　蛋白质的N2端测序　剪下PVDF膜上各蛋白质条带送北京大学生命科学院进行N2端测序,使用Edman降解法,在ABM494A蛋白测序仪上完成。

1.5　主要结构蛋白编码框的确定　根据实验测得的N2端氨基酸残基序列,从G enemark所预测的51个基因表达的蛋白质中查询对应的编码框。

1.6　主要结构蛋白质的一般性质分析　通过DNASTAR和网站http://www.expasy.ch/可对这些结构蛋白的相对分子质量(MW)、等电点(p I)和氨基酸组成等进行分析。

2　结 果
2.1　噬菌体结构蛋白的SDS2PA GE图谱　SDS2 PA GE结果见图1。

电泳后,在凝胶上可以清晰地看到10条带,按相对分子质量从大到小依次编为1～10号,其中第1、3、4等3条带的含量很大,是主要的结构蛋白。

图1　PaP2噬菌体蛋白SDS2PA GE电泳图谱
Figure1　SDS2PA GE of Phage PaP2constituent Proteins(lane
1、2)and molecular mass markers(lane M)
2.2　噬菌体蛋白转印PVDF膜图谱　噬菌体蛋白先经SDS2PA GE分离,再转印到PVDF膜上,染色后如图2所示。

SDS2PA GE分离产生的蛋白条带,经转印后在PVDF膜上有9条清晰可见,只有凝胶上的第7条带为肉眼不可见。

2.3　主要结构蛋白N2端测序结果　切下转印后PVDF膜上各条蛋白带进行测序。

结果得知,凝胶上的第1、3、4、5、8、9带对应蛋白质N2端氨基酸残基序列分别依次是:Met2Ile2G lu2Leu2G ly(M IqL G)、Ala2Ile2Ser2Pro(A ISP)、Ala2Arg2Phe2Ile2Asp (ARFID)、Ser2Val2Tyr2Ala2G ly(SV YA G)、Ala2Ile2 Ser2Arg2Asn(A ISRN)和Ser2Phe2Ser2Leu2G ly(SF2 SL G)。

第2、8带虽然转印后能为肉眼可见,但是因为量少而未能测出N2端序列。

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　第4期 黄建军,等　铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究
图2　PaP2蛋白转印PVDF膜图谱
Figure2　Diagram of phage PaP2constituent proteins trans2 ferred to PADF film
2.4　主要结构蛋白编码框的确定　从G enemark 所预测的51个基因编码产物中查询到N2端氨基酸残基序列分别为M IQL G、MA ISP、MARFID、MSV YA G、A ISRN、SFSL G的蛋白均只有一个,即分别是ORF183********(orf24,direct)、ORF44192 6419(orf8,direct)、ORF16589218322(orf23,direct)、ORF827429530(orf12,direct)、ORF157******** (orf22,direct)和ORF756328309(orf11,direct)编码的蛋白质。

然而,后3个基因编码产物中N2末端的第一个氨基酸残基在N2端测序结果中都已缺失,见表1。

表1　噬菌体PaP2主要结构蛋白编码基因的确定
Table1　Coding gene identification of the major structure pro2 teins in phage PaP2
电泳带实测相对
分子质量
N2端
测序
与实测相对分子
质量相近的ORF
理论相对
分子质量
理论N2端
序列
1200700MIQL G orf24203700MIQL G
375300AISP orf875400M AISP
orf4875700MAINF
459900ARFID orf760200MSDPNQ
orf2363400MARFID
547500SVY AG orf1245200MSVY AG
orf2747600MG DFFQ
832300AISRN orf2231400M AISRN
orf2833600NNY QEY
orf3434700NNLLDV
930500SFS L G orf126900LPNL GY
orf1127100M SFS L G 2.5　主要结构蛋白性质分析　上述ORF的G+C含量及编码蛋白质的等电点等特性见表2。

表2　噬菌体PaP2主要结构蛋白的性质
T able2　Characterization of the ma jor constituent proteins in phage PaP2
电泳带
编码
基因
G+C
(%)
等电点
pH7.0时
电荷
氨基酸
残基总数
疏水氨基
酸残基数
极性氨基
酸残基数1orf2446.16 6.246-8.7261849652492
3orf845.78 6.228-3.785666217202
4orf2346.25 4.865-9.889577189187
5orf1250.44 5.747-4.314418151122
8orf2248.69 5.525-1.06330675153
9orf1149.13 4.835-5.7362497088
3　讨 论
噬菌体是自然界里一个非常大的生物群体,数量达1031之巨7。

它作为菌类微生物的病毒,结构非常简单,由外部的蛋白质衣壳和内部的核酸组成。

本室已经完成了新近分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的全基因组序列(资料待发表),将其全基因组在G enBank上对公共数据库进行检索,表明PaP2是一个未被测序的全新基因组。

对于一个病毒,其结构蛋白(主要是衣壳蛋白和基质蛋白)有着极其重要的生物学意义。

结构蛋白的分离、鉴定及其编码基因的确认是认识该病毒生物学特性的重要途径。

本研究通过SDS2PA GE分离噬菌体PaP2的蛋白质条带,以确定噬菌体主要结构蛋白的数量。

结果表明,噬菌体PaP2颗粒含有10个结构蛋白。

由于调节性蛋白多表达在宿主菌的细胞质中,不会出现在纯化噬菌体颗粒中,因此本文采用纯化的噬菌体颗粒进行SDS2PA GE,分离到的蛋白质当为噬菌体的结构蛋白。

在10个条带中,第1、3、4、5、8、9带含量较大,在转印后PVDF膜上依然清晰可见,足可以供N2端测序之用,而其余4条带则因量少而不能进行末端氨基酸测序。

将N2端测序结果与G enemark预测基因的51个编码产物进行比较后显示,与带1蛋白相对分子质量接近的只有orf22产物,而且带1蛋白的N2端氨基酸残基序列与orf22编码蛋白的完全一致;虽然与带3、4、5蛋白相对分子质量接近的分别有orf 8和orf48、orf7和orf21、orf12和orf27的编码蛋白,但是与N2端测序相匹配的则均只有一个ORF 产物:尽管带3、4、5分别缺失了orf8、orf21、orf12编码蛋白质N2端的第一个氨基酸残基M(Met,甲硫氨酸),接下来的几个氨基酸残基序列却与之完全一致。

检索得知,在G enemark预测的51个基因编码产物中,仅仅只有这6个ORF编码产物N2端的氨基酸残基序列能够与测序结果相匹配,在这6个编码产物的其他位置以及其他编码产物的任何位置都不能发现与测序结果相匹配的氨基酸残基序列。

这即是推定主要结构蛋白编码基因的前提。

有趣的是,这6个蛋白质都是由正链DNA编码的。

噬菌体衣壳蛋白编码基因经过转录生成mRNA,由mRNA翻译形成的蛋白质前体通常还存在一个由蛋白水解酶加工处理的过程,这在噬菌体颗粒装配过程中,为许多噬菌体形态的生成所必
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需1,2。

对不同的噬菌体衣壳蛋白而言,这种翻译后处理的结果表现为五种形式:第一种是不需加工的衣壳蛋白,如噬菌体 KZ的gp146;第二种是仅仅水解掉第一个氨基酸残基———甲硫氨酸残基,其余的氨基酸残基全部保留,如噬菌体 KZ的gp145;第三种是保留氨基端部分,而羧基端部分则被水解切除,如噬菌体P2的gpO;第四种是切除氨基端部分,而保留羧基端部分,如噬菌体 KZ的gp89;第五种是两端都被切除仅仅保留中间部分,如噬菌体 CTX的gp3。

对噬菌体PaP2已经确定编码框的这6个主要衣壳蛋白来说,orf24编码蛋白质属于第一种形式,而orf8、orf11、orf12、orf22、orf23编码蛋白质都属于第二种形式,即水解去除了第一个氨基酸残基———甲硫氨酸残基。

目前在GENBAN K上登录,已经完成全基因组测序的噬菌体有194种,其中铜绿假单胞菌噬菌体为8种。

Rohwer8在对105个噬菌体基因组、总计3981个预测蛋白质进行研究后发现,没有任何一个蛋白质为这105个基因组共有。

来自枯草杆菌噬菌体 SPBc2的糖基转移酶存在最为广泛,但也仅仅为其中的45个基因组共享。

这从一个侧面反映了噬菌体的生物多样性。

我们应用美国NCB I(Na2 tional Center for Biotechnology Information)的BLAST软件对噬菌体PaP2的基因组DNA进行比对分析,在核酸序列比对核酸序列(blastn)时没有任何有意义的结果(分值最高为50,E值最低为0.
29);在核酸序列比对蛋白序列(blastx)时发现了5个有意义的蛋白质:DNA polymeraseⅠ,Ex2 odeoxyribonuclease V,putative helicase,conjugation transfer protein,RecD,这些均是功能性蛋白质,却没有发现与现有噬菌体的结构蛋白同源的蛋白质。

而且,我室自行分离的3株铜绿假单胞菌噬菌体PaP1、PaP2、PaP3之间也不含有保守的结构蛋白质(资料待发表)。

噬菌体PaP2的结构是非常特殊的,其结构蛋白质与目前已知的所有蛋白质的同源性都很低。

本研究确定了噬菌体PaP2的6个主要结构蛋白质的编码基因,为进一步研究这些蛋白质的功能奠定了基础。

参考文献:
1　Mesyanzhinov VV,Robben J,Grymonprez B.The G enome of bacteriophage KZ of Pseudomonas aerugi nosa J.J Mol Biol,
2002,317(1):1219.
2　Nakayama K,K anaya S,Ohnishi M et al.The complete nu2 cleotide sequence of CTX,a cytotoxin2converting phage of
Pseudomonas aerugi nosa:implications for phage evolution and horizontal gene transfer via bacteriophages J.Mol Microbiol,
1999,31(2):3992419.
3　K ovalyova IV,Kropinski AM.The complete genomic sequence of lytic bacteriophage gh21infecting Pseudomonas puti da2evidence for close relationship to the T7group J.Virolo gy,2003,311
(2):3052315.
4　Paul G,Christiaan P,Hui W et al.Characterization of 12,a bacteriophage related to 6:nucleotide sequence of the large double2stranded RNAJ.Virolo gy,2002,295(2):2662271.
5　张克斌,陈志瑾,金晓琳等.铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定J.微生物学通报,2002,29(1): 40245.
6　J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南M.第二版,北京:科学出版社,1996.8802886.
7　Hendrix RW.Bacteriophage genomicsJ.Curr O pin Microbiol, 2003,6(5):5062511.
8　Rohwer F.The phage proteomic tree:a genome2based taxonomy for phageJ.J Bacteriol,2002,184(16):452924535.
(责任编辑:李风华;　英文编辑:李幼生)
(上接第291页)
参考文献:
1　Qian Y,Shi WH,Ding J T et al.Predictive value of the area of expanded cumulus mass on development of porcine oocyte ma2
tured and fertilized in vitro J.J Re prod Dev,2003,49(2):
1672174.
2　K ahraman S,Y akin K,Donmez E et al.Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following
intracytoplasmic sperm injection J.Hum Re prod,2000,15
(11):239022393.
3　Xia P.Intracytoplasmic sperm injection:correlation of oocyte grade based on polar body,perivitelline space and cytoplasmic in2
clusions with fertilization rate and embryo quality J.Hum Re2
prod,1997,12(8):175021755.
4　Loutradis D,Drakakis P,K allianidis K et al.Oocyte morpholo2 gy correlates with embryo quality and pregnancy rate after intra2
cytoplasmic sperm injection J.Fertil Steril,1999,72(2):
2402244.
5　Balaban B,Urman B,Sertac A et al.Oocyte morphology does not affect fertilization rate,embryo quality and implantation rate
after intracytoplasmic sperm injection J.Hum Re prod,1998,
13(12):343123433.
6　De Sutter P,Dozortsev D,Qian C et al.Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after
intracytoplasmic sperm injection J.Hum Re prod,1996,11
(3):5952597.
7　Picton HM,Briggs D,G osden RG.The molecular basis of oocyte growth and development J.Mol Cell Endocrinol,1998,
145(122):27237.
8　Sundstrom P,Nilsson BO.Meiotic and cytoplasmic maturation of oocytes collected in stimulated cycles is asynchronous J.
Hum.Reprod,1988,3(5):6132619.
9　Mikkelsen AL,Lindenberg S.Morphology of in2vitro matured oocytes:impact on fertility potential and embryo quality J.
Hum Reprod,2001,16(8):171421718.
10　Martini E,Flaherty SP,Swann NJ et al.Analysis of unfertil2 ized oocytes subjected to intracytoplasmic sperm injection using
two rounds of fluorescence in2situ hybridization and probes to
fuve chromosomes J.Hum Re prod,1997,12(9):20112 2018.
11　Eichenlaub2Ritter U,Schmiady H,K entenich H et al.Recur2 rent failure in polar boby formation and premature chromosome
condensation in oocytes from a human patient:indicators of
asynchrony in nuclear and cytoplasmic maturationJ.Hum Re2 prod,1995,10(9):234322349.
12　K oster J G,Destree OH,Raat NJ et al.Histones in Xenopus laevis’early development:the race against time J.Biomed
Biochim Acta,1990,49(829):8552877.
(责任编辑:陈根达;　英文编辑:朱维铭)
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