《高通量测序与大数据分析-农学篇》多组学研究2(共2)
基于高通量测序数据的数据挖掘与分析
基于高通量测序数据的数据挖掘与分析高通量测序（High-throughput sequencing）技术的快速发展，使得基因组学、转录组学、表观基因组学等领域的数据量急剧增加，这也为数据挖掘与分析的发展提供了巨大的机遇。
简单来说，高通量测序数据挖掘是一种从海量的高通量测序数据中提取信息的手段，通过研究基因组、转录组、表观基因组等各类数据的变化规律，可以深入了解生命科学的本质和规律。
一、高通量测序数据挖掘的基本流程高通量测序数据挖掘的基本流程包括数据清洗、序列比对、变异检测和功能注释等步骤。
其中，数据清洗是保证高通量测序数据质量和准确性的重要前置步骤；序列比对则是通过将高通量测序数据与生物信息数据库比对，实现数据挖掘的具体过程；变异检测则可以实现组织间基因表达谱的比较和差异的鉴定；而功能注释是对高通量测序数据挖掘结果的解释和理解。
1. 数据清洗数据清洗通常是第一步，它可以帮助我们从原本的测序数据中去除掉低质量或者错误的序列。
高通量测序数据中可能会存在一些因为仪器或实验因素导致的低质量序列和存在PCR 扩增自由度的重复序列，这些都会影响实际研究过程中的结果。
数据清洗通常包括质量控制、去除接头、过滤 PCR 重复序列等过程。
2. 序列比对序列比对是高通量测序数据挖掘的核心环节，它可以把测序的 DNA 或 RNA序列比对到参考基因组上，以引导序列注释和变异检测。
序列比对技术目前广泛采用的是 Bowtie、TopHat 等算法，在此基础上发展了一系列的变种算法，例如，Shrimp、BSMAP、HISAT2 等。
3. 变异检测变异检测是指通过对比不同组织间的基因表达情况，或者对比同一组织间的基因表达情况，从而找到组织间的差异，并且解释并分析这些差异的基因变化。
变异检测依赖于一些基本的评估基因表达差异的算法，例如 DESeq、edgeR、DEGseq 等等。
4. 功能注释功能注释是对数据挖掘结果的解释和理解。
一文读懂高通量测序技术与研究（套路和实例分析）
一文读懂高通量测序技术与研究（套路和实例分析）作者：解螺旋·科研大V团队如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语高通量测序技术和普通基因测序最大的不同在于，高通量测序能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，也就是基因测序里的“批处理”。
高通量测序经过近十年来的迅猛发展，已经深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，也在逐渐征服临床应用。
所谓的高通量测序技术，又名大规模平行测序，是将DNA（或者cDNA）随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆(Colony)进行延伸反应，检测对应的信号，最终获取序列信息。
与Sanger法为代表的传统测序法相比，高通量测序技术在处理大规模样品时具有显著的优势，又快（两天）又多（数百万克隆），成为目前组学研究的主要技术。
当前主要的测序技术平台，主要分为：•solexa测序技术（即大家耳熟能详的illumina测序平台）；•454测序技术（读长长，但是准确度较低，成本较高，即焦磷酸测序技术，少量市场占有）；•solid测序技术（双色编码技术，目前基本在市场上见不到了）那么高通量测序技术可以帮助我们做到什么呢？基因组层面的应用对于疾病诊断领域，全基因组重测序技术是一种非常有力的手段。
所谓的全基因组重测序，即对基因组序列已知物种的个体（比如人，小鼠等）进行基因组测序，并进行差异信息分析的方法。
基于全基因组测序，可以快速的寻找到大量的遗传差异，从而实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测，找到大量的SNP，InDel，结构变异（SVs）等变异信息，从而获取生物群体的遗传特征。
临床上，常规的产前诊断技术是需要通过穿刺（绒毛穿刺、羊膜腔穿刺等）的方法取得胎儿的组织进行遗传学检测，这可能导致一定的流产风险。
而在1997年，Lo团队[1]发现了孕妇外周血中存在有胎儿的游离DNA，而高通量测序技术可以针对短序列DNA进行精准的测序。
DNA高通量测序和生物大数据的分析和挖掘
DNA高通量测序和生物大数据的分析和挖掘随着生物学和医学科技的不断发展，越来越多的科学家使用了DNA 高通量测序技术来探索人类基因组和它们所扮演的角色，从而争取提高健康和疾病的预防和治疗。
由于 DNA 测序技术的快速发展和数据大量积累，生物大数据的分析和挖掘变得至关重要。
DNA 高通量测序是一种高效的 DNA 测序技术，可以在较短时间内对人类基因组进行高质量测序，对人类基因组和其变异进行研究，从而揭示不同人类基因组间的异质性。
在 DNA 高通量测序中，首先需要将 DNA 样本进行分离和净化，通过 PCR 扩增和文库构建，可以获得适合测序的 DNA 片段。
这些 DNA 片段随后被大规模测序，从而生成海量数据，包括不同样本的 DNA 序列信息。
当所有样本的 DNA 测序完成之后，接下来就是生物大数据的分析和挖掘。
这些数据包含了大量的关于基因和基因表达的信息，也包含了有关基因组的不同变异和微小性别差异的信息。
生物大数据可以用于许多不同领域，例如生物医学研究、癌症研究、流行病学和高级数据分析。
DNA 高通量测序和生物大数据的分析和挖掘对于医学研究来说是具有巨大潜力的。
例如，在遗传性疾病的研究中，可以将一组患者和对照组之间的基因组进行比较。
这样，可以发现一些可能与遗传性疾病有关的基因，并了解这些基因是否在患者中发生了突变。
此外，生物大数据还可以用于癌症研究。
通过分析不同肿瘤患者的基因组，可以发现某些肿瘤存在特定的突变，可以为患者提供更好的诊断和治疗。
除了用于医学研究外，生物大数据还被广泛用于生物进化和生态学研究。
例如，在研究动物和植物的进化过程中，可以通过比较不同物种的基因组以及它们的基因表达模式，来了解它们在进化过程中的异同之处。
在生态学研究中，可以使用 DNA 高通量测序技术来分析各种生物群落中的基因，理解生物群落的结构以及它们对环境的影响。
然而，面对大量的生物大数据，如何进行有效的分析和挖掘成为了一个挑战。
高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性
中国农业科技导报，2021,23(2)：73-80Journal of Agricultural Science and Technology高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性刘璐1,名晓东1,张晓艳2,郝俊杰2,付丽平1,王乾坤1,吕鑫1,陈旺1,刘全兰1*(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266042；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛266100)摘要:为了分析蚕豆种子内生细菌的多样性，采用1llumina MiSeq高通量测序技术，从日本大白皮(S18P23.1、S18P23.2)和启豆2号(S18P24.1.S18P24.2)的种子获得16S RNA V3~V4区有效序列133855条。
将高于97%相似度的序列划分为一个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),优化后得到1598个OTUs。
内生细菌种群分析结果表明，拟杆菌门(Bacteroidetes,丰度为30%-33%)、变形菌门(Proteobacteria,23%~25%)、厚壁菌门(Firmicutes,23%-25%)和放线菌门(Actinobacteria,5%~7%)为两个蚕豆品种共有的优势菌门，但属水平的优势菌群在供试蚕豆种子中均有差异。
这些结果表明，蚕豆种子具有 丰富的内生细菌资源，含有多种具有益功能性状的细菌类群，值得进一步跟踪研究这些益生菌在蚕豆种植到土壤后的变化规律;启豆2号种子中益生菌的种类和丰度高于日本大白皮，值得进一步分离和研究这些益生菌的益生或促生特性，筛选获得在食品和生物肥料等领域有应用潜力的菌株。
关键词：高通量测序;蚕豆；内生细菌;多样性doi:10.13304/j.nykjdb.2019.0860中图分类号:S664.143.6文献标识码：A文章编号：1008-0864(2021)02-0073-08Diversity of Endophytic Bacteria in Faba BeanSeeds by High-Throughput SequencingL1U Lu1,M1NG Xiaodong1,ZHANG Xiaoyan2,HAO Junjie2,FU Liping1,WANG Qiankun1,LYU Xin1,CHEN Wang1,L1U Quanlan1*(1.College of Marine Science and Biological Engineering,Qingdao Lniversity of Science&Technology,ShandongQingdao266042,China； 2.Qingdao Academy of Agricultural Sciences,Shandong Qingdao266100,China)Abstract：1n order to analyze the species abundance and diversity of endophytic bacteria in faba bean seeds,taking Japan^s white skin(S18P23.1,S18P23.2)and Qidou2(S18P24.1,S18P24.2)as materials,133855effective sequences were obtained by1llumina MiSeq high-throughput sequencing of the16S rRNA V3~V4region.The sequence with similarity above97%was divided into one operational taxonomy unit(OTU),so1598OTUs were obtained after optimization.The results showed that majority of the endophytic bacteria belonged to Bacteroidetes (30%~33%),Proteobacteria(23%~25%),Firmicutes(23%~25%),and Actinobacteria(5%~7%),which were therefore the dominant bacterial Phyla in these four faba bean seeds.The dominant genera at genus level in these endophytic bacteria sequenced from faba bean seeds were different.Above results indicated faba bean seeds were rich in endophytic bacteria,the abundance of probiotics in one faba bean variety(Qidou2)were higher than another variety(Japan's white skin).Key words:high-throughput sequencing；faba bean seed；endophytic bacterium；diversity蚕豆(Vicia faba L.)属豆科蝶形花亚科野豌豆族野豌豆属，起源于亚洲西南部和非洲北部[1-2]o蚕豆营养丰富，含有蛋白质、糖类、脂质、膳食纤维以及钙、铁、胡萝卜素、维生素等;蚕豆中含有人体中不能合成的8种必需氨基酸，其中赖氨酸含量较高[3]o蚕豆还有利湿消肿、清热健收稿日期：2019-10-17；接受日期：2019-12-18基金项目：国家食用豆产业技术体系项目(CARS-08)；青岛市农业科学研究院院长基金项目。
高通量测序数据分析解释
生信分析
1.稀释性曲线（RarefactionCurve）
采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表 OTU 的数目构建曲线，即稀释性曲线。
当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量对发现新 OTU 的 边际贡献很小；反之则表明继续测序还可能产生较多新的 OTU。
横轴：从某个样品中随机抽取的测序条数；"Label0.03"表示该分析是基于 OTU 序列差异水平在 0.03，即相似度为 97%的水平上进行运算的，客户可以选 取其他不同的相似度水平。
而近年来以 454 焦磷酸测序为代表的高通量测序技术凭借低成本、高通量、 流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。Roche454 高通 量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测， 获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。最近，美吉生物推出了 新 的 测 序 平 台 ———MiSeq 。 MiSeq 高 通 量 测 序 平 台 集 中 了 Roche454 和 IlluminaHiSeq2500 的优点，不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序，而且在 测序速度和测序通量上都有进一步提升，目前此平台已在微生物多样性群落结构 研究方面受到了广大学者的认可。
纵轴：基于该测序条数能构建的 OTU 数量。 曲线解读： Ø 图 1 中每条曲线代表一个样品，用不同颜色标记； Ø 随测序深度增加，被发现 OTU 的数量增加。当曲线趋于平缓时表示此时 的测序数据量较为合理。
2.Shannon-Wiener 曲线
反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的 微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。
生命科学中的高通量数据分析
生命科学中的高通量数据分析一、引言生命科学领域中的高通量数据分析是当今在科学研究中十分重要的。
在遗传学、生物学和医学等领域中，高通量数据分析发挥着巨大的作用。
随着现代技术的发展，科学家们可以获取更多的生物信息数据，如基因、蛋白质、代谢产物等等。
因此，为了理解这些数据中隐藏的信息，高通量数据分析就成为了必不可少的工具。
二、DNA测序数据分析高通量DNA测序是现代生物学研究中必不可少的工具之一。
DNA测序可以用来确定DNA的序列，它为分析遗传信息提供了全新的机会。
然而，DNA测序数据生成速度比分析速度要快得多，这就需要高通量数据分析的支持。
DNA测序数据分析的基本步骤包括数据质量处理、序列比对、变异检测和注释。
其中，序列比对对于高通量数据分析十分重要。
目前，常用的序列比对软件包括Bowtie、BLAST、BWA以及GEM等。
三、蛋白质组学数据分析蛋白质组学数据分析是生命科学领域中一个热门的研究方向。
随着质谱技术的不断发展，鉴定蛋白质质量比以往更加准确。
蛋白质组学数据分析的主要步骤包括质谱数据预处理、特征提取和鉴定。
质谱数据预处理是必不可少的，因为原始数据中常常包含损坏、重叠、缺失或噪声等方面的问题。
特征提取是比较难的一个环节，通常需要基于计算机视觉方法建模，包括特征选择、降维和分类。
鉴定则是蛋白质组学数据分析的最后一步。
当前，常用的蛋白质组学数据分析软件包括MaxQuant、Mascot、Proteome Discoverer以及Scaffold等。
四、单细胞数据分析单细胞数据分析在最近几年开始受到重视。
尽管基因表达水平在细胞间存在巨大的异质性，但是传统的方法所得到的数据只是对大量细胞的表达水平的平均值，不够精细。
随着现代技术的发展，人们可以获取更多的单细胞数据。
单细胞数据分析的主要步骤包括数据预处理、质量控制、特征选择和数据可视化。
由于单细胞数据的特点，常用的分析方法也与传统的方法不同。
例如，对于单细胞数据，常用的特征选择方法是基于转录组奇异值分解（SVD）的方法。
高通量测序及其在食物网解析中的应用进展_pdf (2)
第３７卷第８期２０１７年４月生态学报ＡＣＴＡＥＣＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶｏｌ．３７，Ｎｏ．８Ａｐｒ．，２０１７基金项目：国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０１）；浙江省自然科学基金项目（ＬＹ１６Ｃ１４０００２）；科技部国家 ９７３ 基础重点研究发展规划项目（２０１０ＣＢ１２６２００）收稿日期：２０１５⁃１１⁃１６；㊀㊀网络出版日期：２０１６⁃１０⁃２９∗通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊａｃｈｅｎｇ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎＤＯＩ：１０．５８４６／ｓｔｘｂ２０１５１１１６２３１７王雪芹，王光华，乔飞，高其康，ＫｏｎｇＬｕｅｎＨＥＯＮＧ，祝增荣，程家安．高通量测序及其在食物网解析中的应用进展．生态学报，２０１７，３７（８）：２５３０⁃２５３９．ＷａｎｇＸＱ，ＷａｎｇＧＨ，ＱｉａｏＦ，ＧａｏＱＫ，ＫｏｎｇＬｕｅｎＨＥＯＮＧ，ＺｈｕＺＲ，ＣｈｅｎｇＪＡ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｆｏｏｄｗｅｂａｎａｌｙｓｉｓ．ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１７，３７（８）：２５３０⁃２５３９．高通量测序及其在食物网解析中的应用进展王雪芹１，２，王光华１，２，乔㊀飞１，２，高其康２，３，ＫｏｎｇＬｕｅｎＨＥＯＮＧ１，２，祝增荣１，２，程家安１，２，∗１浙江大学水稻生物学国家重点实验室，杭州㊀３１００５８２浙江大学昆虫科学研究所，杭州㊀３１００５８３浙江大学农生环学部分析测试中心，杭州㊀３１００５８摘要：高通量测序是ＤＮＡ测序技术发展中的重大突破，它的出现为现代生物科学研究提供了前所未有的机遇，例如基于猎物和寄主植物ＤＮＡ分子解析生态系统的食物网研究已逐渐成为捕食性动物与植食性动物食物网研究的新型模式㊂在简要总结Ｒｏｃｈｅ４５４㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ为代表的第二代测序技术的原理及最新进展的基础上，综述了近年来利用高通量测序技术在捕食性和植食性动物食物网解析构建研究方面取得的最新进展及存在的问题，以期为探索捕食性和植食性动物的猎物／寄主范围㊁猎物／寄主转换㊁资源分配㊁生物防治㊁生物保护和生态恢复新方法提供思路和启发㊂关键词：第二代测序；捕食／植食性动物；营养关系；食物转换；宏条形码技术Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｆｏｏｄｗｅｂａｎａｌｙｓｉｓＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎ１，２，ＷＡＮＧＧｕａｎｇｈｕａ１，２，ＱＩＡＯＦｅｉ１，２，ＧＡＯＱｉｋａｎｇ２，３，ＫｏｎｇＬｕｅｎＨＥＯＮＧ１，２，ＺＨＵＺｅｎｇｒｏｎｇ１，２，ＣＨＥＮＧＪｉａａｎ１，２，∗１ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｉｃｅＢｉｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５８，Ｃｈｉｎａ２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５８，Ｃｈｉｎａ３ＡｎａｌｙｓｉｓＣｅｎｔｅｒｏｆＡｇｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５８，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｓａｍａｊｏｒｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙｆｏｒｍｏｄｅｒｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅＤＮＡ⁃ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈｔｒａｃｋｉｎｇｔｈｅｆｏｏｄｃｈａｉｎｓａｍｏｎｇｐｒｅｄａｔｏｒｓ⁃ｐｒｅｙｏｒｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ⁃ｈｏｓｔｐｌａｎｔｓｔｒｏｐｈｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｓａｎｄｃｏｍｐａｒｅｓｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｔｙｐｅｓｏｆｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅＲｏｃｈｅ４５４，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ａｎｄＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ａｎｄｏｔｈｅｒｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｗｅａｌｓｏｓｕｍｍａｒｉｚｅｓｔｕｄｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｕｓｅｄｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｓｔｕｄｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｍｏｎｇｇｅｎｅｒａｌｉｓｔｐｒｅｄａｔｏｒｓ／ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｅｙ／ｈｏｓｔｓ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｎｏｖｅｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｅｘｐｌｏｒｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｒｏｐｈｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇｏｕｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｐｒｅｙ／ｈｏｓｔｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｐｒｅｙ／ｈｏｓｔｓｈｉｆｔ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌ，ｒｅｓｏｕｒｃｅａｌｌｏｃａｔｉｏｎ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔｐｒｅｄａｔｏｒ；ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔｈｅｒｂｉｖｏｒｅ；ｔｒｏｐｈｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ；ｄｉｅｔｓｗｉｔｃｈｉｎｇ；ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ１９７０年代中期，英国生物化学家Ｓａｎｇｅｒ发明了Ｓａｎｇｅｒ测序法（双脱氧核苷酸末端终止法），为科研人员开启了深入研究生命遗传密码的大门，Ｓａｎｇｅｒ也因此获得１９８０年的诺贝尔化学奖［１⁃２］㊂自１９７７年以Ｓａｎｇｅｒ法为代表的第一代测序技术帮助人们完成了第一个完整基因组图谱的绘制以来，测序技术不断发展进步㊂进入２１世纪后，以Ｒｏｃｈｅ４５４㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ等测序系统为代表的第二代测序技术诞生，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能［３］㊂第二代测序技术又称高通量测序技术（ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＨＴＳ），下一代测序技术（ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ），它能一次并行对几十万到几百万条ＤＮＡ分子进行序列测定，具有测序通量高㊁速度快及成本低等优点，是ＤＮＡ测序发展历程的一个里程碑，使人们进入了基因组和后基因组时代［４］，为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇㊂基于高通量测序技术获得生物特异性基因识别ＤＮＡ条形码序列的扩增子测序方法，称为ＤＮＡ宏条形码技术（ＤＮＡＭｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ）㊂该技术可将整个混合样本的ＤＮＡ片段扩增后再进行高通量测序，进而确定取样环境中生物的分布状况，目前已用于微生物和动物等环境ＤＮＡ（ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＤＮＡ，ｅＤＮＡ）科学方面的研究［５⁃６］㊂ＤＮＡ宏条形码技术具有快速㊁灵敏㊁可重复㊁高效及省时省力等优点，不仅为生物多样性调查提供了高效有力的方法，而且在环境监测㊁资源管理和生态评估等方面具有重要的意义［７⁃１０］㊂食物网是生物群落内各物种之间营养关系的基本联系，反映了自然界各种生物之间相互依存㊁相互制约㊁协同进化等互作关系的自然属性，其研究结果可直接体现生态群落的功能结构，因此物种间食物网的研究始终是生态学中非常重要和活跃的研究领域［１１］㊂近年来，基于ＤＮＡ宏条形码技术分子解析构建捕食者⁃猎物和植食者⁃植物营养关系研究发展迅速，并逐渐成为食物网研究的新型模式［１２］，高通量测序的出现为研究捕食性和植食性动物复杂的食物网提供了前所未有的机遇［１３］㊂本文在简要总结以Ｒｏｃｈｅ４５４㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ为代表的高通量测序技术原理及最新进展的基础上，综述了近年来基于高通量测序的ＤＮＡ宏条形码技术在食物网解析构建方面的应用现状和发展前景，以期为探索捕食／植食性动物的猎物／寄主范围㊁猎物／寄主转换㊁资源分配㊁生物防治㊁生物保护和生态恢复新方法提供思路和启发㊂１㊀高通量测序技术原理及发展第二代测序技术以高通量低成本为其主要特征，并在此基础上保持了第一代测序技术的高准确性㊂第二代测序技术主要包括基于合成测序（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳＢＳ）的Ｒｏｃｈｅ４５４，Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ测序技术［３，１４⁃１６］㊂１．１㊀Ｒｏｃｈｅ４５４测序技术原理２００５年，４５４生命科学公司生产了第一台商品化的高通量测序仪⁃基因组测序２０［１７］㊂４５４测序仪利用焦磷酸法测序（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），其原理是：首先将长度合适的单链ＤＮＡ片段连接测序接头和模板接头制备成样品文库（图１Ａ中文库制备）㊂将固化引物的磁珠与样品文库制成 一个磁珠＝一个ＤＮＡ片段 的微反应器，进行多轮油包水乳滴ＰＣＲ（ｅｍｕｌｓｉｏｎＰＣＲ，ｅｍＰＣＲ）后，每个磁珠表面都结合了数千个相同的ＤＮＡ拷贝，形成 一个磁珠＝一个读长序列 （图１Ａ中模板制备）㊂然后富集磁珠到微孔板上，每个微孔容纳一个磁珠，微孔板为流通池的一部分，其中一面通过测序反应的化合物，另一面则与ＣＣＤ光学检测系统的光纤相接触㊂碱基测定采用边合成边测序，利用ＡＴＰ硫酰化酶和荧光素酶在三磷酸核苷结合到ＤＮＡ链上释放焦磷酸基团（ＰＰｉ）光信号（图１Ａ中测序技术）㊂顺次向流通池中加入４种ｄＮＴＰ中的一种，通过每个微孔之中释放的光信号确定ＤＮＡ模板上的互补碱基，从而实现对ＤＮＡ片段的准确快速测定［１８］㊂目前４５４技术平台读取长度达到６００ １０００ｂｐ，使得后继的序列拼接工作更加高效㊁准确，但测序通量相对较低和成本较高是其发展的瓶颈（表１）㊂近年来，随着测序技术的发展，后来上市的测序仪（如Ｉｌｌｕｍｉｎａ的ＭｉＳｅｑ和ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ的ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ系统）更是将４５４仪器排挤到研究边缘，因此罗氏关闭了４５４义务，联合ＰａｃＢｉｏ公司发展第三代测序技术［１９］㊂１．２㊀Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序技术原理Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ于２００６年问世㊂首先把待测序列打断成２００ ５００ｂｐ的小片段，两端加１３５２㊀８期㊀㊀㊀王雪芹㊀等：高通量测序及其在食物网解析中的应用进展㊀２３５２㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３７卷㊀上不同的接头，连接载体，构建单链ＤＮＡ文库（图１Ｂ中文库制备）㊂ＤＮＡ转移到表面固定有很多接头的８泳道微纤维板组成的流动槽，向反应体系中添加核苷酸和酶，进行桥式ＰＣＲ（ＢｒｉｄｇｅＰＣＲ）㊂ＢｒｉｄｇｅＰＣＲ以流动槽表面固定的接头为模板，将桥型单链ＤＮＡ扩增成桥型双链ＤＮＡ，经过不断的变性扩增循环，每种单链ＤＮＡ都在各自的位置产生约２０００个分子的高密度ＤＮＡ簇（图１Ｂ中模板制备）㊂ＤＮＡ簇在ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ综合分析仪上进行序列分析㊂向反应体系中同时添加ＤＮＡ聚合酶㊁接头引物和带有碱基特异荧光标记的４种ｄＮＴＰ㊂由于这些ｄＮＴＰ的３ᶄ羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加１个ｄＮＴＰ㊂在ｄＮＴＰ被添加到合成链上后，未使用的游离ｄＮＴＰ和ＤＮＡ聚合酶会被洗脱㊂加入激发荧光缓冲液，用光学设备记录激光激发的荧光信号，再通过计算机分析转化为测序结果㊂信号记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除ｄＮＴＰ的３ᶄ羟基保护基团，进行下一轮测序反应（图１Ｂ中测序技术）［１６］㊂目前Ｉｌｌｕｍｉｎａ最新的测序平台的读取长度可以达到２ˑ１５０ｂｐ（Ｈｉｓｅｑ４０００），２ˑ３００ｂｐ（Ｍｉｓｅｑ３００），通量高和成本较低是其占据市场的优势（表１）㊂１．３㊀ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ测序技术原理ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ测序原理是在半导体芯片的微孔中固定纳米尺度的连接１００万条相同ＤＮＡ片段的磁珠（ＩｏｎＳｐｈｅｒｅＴＭ）形成微型反应池（图１Ｃ中模板制备），随后依次掺入ＡＣＧＴ㊂随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，改变反应溶液的ｐＨ值，离子传感器检测到ｐＨ变化后，实时判读碱基，即刻从化学信息转变为数字电子信息（图１Ｃ中测序技术）［２０］㊂这种方法直接检测ＤＮＡ的合成，少了ＣＣＤ扫描，荧光激发等环节，大大缩短了运行时间㊂这种技术跟芯片连接在一起，使得生物学和计算机学完全融为一体，创造了技术上的革新㊂ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ测序平台有ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭ（ＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ）和ＩｏｎＰｒｏｔｏｎ两种测序仪㊂ＰＧＭ有３种芯片可供选择，ＩｏｎＰｒｏｔｏｎ目前仅有ＰＩ芯片㊂芯片技术的发展使测序仪２ｈ碱基产量从１０Ｍｂ提升到１０Ｇｂ㊂伴随着试剂的优化和测序通量的提高，ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ读取长度也从２０１１年的２００ｂｐ提升到目前的４００ｂｐ㊂不断提高的芯片密度㊁读取长度和优化的数据处理方式，将使ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ的测序通量在不久的将来进一步提高（表１）［２１⁃２２］㊂表１㊀Ｒｏｃｈｅ４５４㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ常用高通量测序平台主要技术参数和测序通量Ｔａｂｌｅ１㊀ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｄａｔａｏｕｔｐｕｔｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＲｏｃｈｅ４５４，ＩｌｌｕｍｉｎａａｎｄＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＮＧＳｐｌａｔｆｏｒｍｓ公司平台模板制备测序方法错误类型运行时间数据量ＣｏｍｐａｎｙＰｌａｔｆｏｒｍＴｅｍｐｌａｔｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｈｅｍｉｓｔｒｙＥｒｒｏｒｔｙｐｅＲｕｎｔｉｍｅＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＲｏｃｈｅ４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒ微磁珠乳滴ＰＣＲ焦磷酸测序法插入缺失１０ｈ３５ＭＢ４５４ＦＬＸＴｉｔａｎｉｕｍ１０ｈ４５０ＭＢ４５４ＦＬＸ＋２３ｈ７００ＭＢＩｌｌｕｍｉｎａＩｌｌｕｍｉｎａＧＡＩＩｘ流动槽桥式ＰＣＲ可逆终止子合成测序法替换６ｄ１ＴＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２５００６ｄ１ＴＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ４０００３．５ｄ１．５ＴＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｓｅｑ２．５ｄ１５ＧＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＩｏｎＰＧＭ（３１６Ｃｈｉｐ）微磁珠乳滴ＰＣＲ半导体化学合成测序法替换４．９ｈ６００ＭＢＩｏｎＰＧＭ（３１８Ｃｈｉｐ）７．３ｈ２Ｇ㊀ＩｏｎＰｒｏｔｏｎ（ＰＩＣｈｉｐ）㊀㊀㊀４ｈ１０Ｇ１．４㊀第三代测序技术Ｒｏｃｈｅ４５４㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ为代表的这些平台原理各有不同，在通量㊁读长㊁准确度㊁速度和成本方面各具优势，目前已经广泛地应用于各项研究领域，并且在测序市场占有绝对优势地位㊂但是，近年来基于单个分子信号检测的单分子测序（ＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＳＭＳ），或第三代测序（ＴｈｉｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ）技术发展快速，这些新技术包括ＰａｃＢｉｏ的单分子实时测序（ＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＲｅａｌ⁃ｔｉｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＳＭＲＴ），Ｈｅｌｉｃｏｓ的真正单分子测序（ＴｒｕｅＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔＳＭＳ）和Ｏｘｆｏｒｄ的纳米孔测图１㊀Ｒｏｃｈｅ４５４（Ａ）㊁Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｂ）和ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｃ）３种常用高通量测序平台工作原理比较图（改编自ＤｅｌＣｈｉｅｒｉｃｏ等［２３］）Ｆｉｇ．１㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｃｈｅｍｅｓｆｒｏｍｌｉｂｒａｒｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｔｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｍｏｎｇＲｏｃｈｅ４５４（Ａ），Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｂ）ａｎｄＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｃ）（ＭｏｄｉｆｉｅｄｆｒｏｍＤｅｌＣｈｉｅｒｉｃｏｅｔａｌ．［２３］）序（ＮａｎｏｐｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等［２４］㊂２㊀高通量测序在食物网研究中的应用生态学是探索生物与环境关系的学科，而特定生态系统中物种间的食物联系，或食物网常是生态学研究的重点之一㊂数十年来，国际上植物⁃植食性生物⁃捕食性生物的食物网研究方法主要分为三大类，即传统方法（野外人工或摄像观察法㊁田间笼罩法㊁消化道内容物解剖分析法），生化方法（脂肪酸分析法㊁稳定同位素技术㊁蛋白质电泳分析法）和现代分子方法（多克隆抗体和单克隆抗体技术㊁ＤＮＡ分子技术），这些方法针对不同环境和研究对象各有其优缺点［２５⁃２６］㊂传统方法直观快速㊁可信度高，适用简单环境下大型动物的取食，不足之处是耗时耗力，具有偶然性；生化分析方法相对简便㊁效率高，适用于多种生态系统，缺点是不同生物之间成分的组成和重合㊁样品的处理方式等都会影响准确评估摄食信息；猎物蛋白抗体技术相对比较准确㊁甚至可以制作特定发育阶段的单克隆抗体，适合研究某种或几种特定猎物的捕食者，劣势之处是抗体制备繁琐㊁需要特殊细胞和组织培养系统，耗时长，成本高㊂近来，随着物种分子鉴定技术的发展和ＮＣＢＩ㊁ＢＯＬＤ等数据库的丰富完善，ＤＮＡ分子追踪食物链和食物网正成为分子生态学营养关系研究的主流方法［２６］㊂３３５２㊀８期㊀㊀㊀王雪芹㊀等：高通量测序及其在食物网解析中的应用进展㊀４３５２㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３７卷㊀基于高通量测序的ＤＮＡｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ分子解析食物方法不受猎物种类限制，尤其适合研究陆地和海洋等自然生态系统中具有不同生物学和生态学特性的广食性动物不同时空条件下的复杂食物网结构㊁时空转换和食物资源分配等㊂目前，该方法已广泛应用于捕食者⁃猎物和植食者⁃寄主植物食物链研究，进而可以组合开展食物网的研究，如基于消化道内容物或粪便ＤＮＡ研究动物的食性以及在生态系统中的作用［６，２７⁃２８］㊂该技术不仅可以通过计算测序产生序列的种类数定性和比较不同食物序列的相对丰度定量分析食物网内不同物种之间的关系［２９⁃３１］，而且可以分析不同时空尺度下的食物网结构特征和食物转换，以解决生态学㊁生物进化㊁生物保护和种群群落构建恢复等方面的问题［６，２８］㊂例如，高通量测序通过对不同广食性捕食者或植食者样品消化道内容物或粪便样品进行ＰＣＲ扩增时在引物的５ᶄ末端加上由不同碱基组成的多重识别标签（ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＭＩＤｓ），就能在一次测序中对不同来源，不同种类的广食性动物的各种猎物残留或寄主植物目标序列进行测序分析，既节约了时间㊁人力和物力，又避免了污染，具有简便㊁快速和信息量大等特点［１３，３２］㊂分子生态学杂志在２０１４年８月出版了专刊，对该技术的研究和分析方法以及应用领域进行了广泛的讨论［２８］㊂２．１㊀捕食性脊椎动物Ｄｅａｇｌｅ等［３３］通过ＲｏｃｈｅＧＳ⁃ＦＬＸ平台研究了澳大利亚塔斯马尼亚岛３个不同海域的南非海狗Ａｒｃｔｏｃｅｐｈａｌｕｓｐｕｓｉｌｌｕｓｄｏｒｉｆｅｒｕｓ的２７０份粪便样本，结果显示南非海狗的主要猎物为新西兰红珍珠鱼Ｅｍｍｅｌｉｃｈｔｈｙｓｎｉｔｉｄｕｓ和青背竹筴鱼Ｔｒａｃｈｕｒｕｓｄｅｃｌｉｖｉｓ，并且发现以前不被重视的澳洲鲭Ｓｃｏｍｂｅｒａｕｓｔｒａｌａｓｉｃｕｓ也是其重要猎物，这是宏条形码技术在捕食性动物食物网研究中的第一次应用，从而使得对大规模的野生动物的食物组成的研究成为可能㊂本土珍稀物种的保护和培育甚至迁地保护是生物保护的重要内容㊂Ｂｒｏｗｎ等［３４］通过Ｒｏｃｈｅ４５４测序研究毛里求斯马埃堡自然保护区本土珍稀物种蜥蜴Ｌｅｉｏｌｏｐｉｓｍａｔｅｌｆａｉｒｉｉ和入侵鼩鼱ＳｕｎｃｕｓＭｕｒｉｎｕｓ的猎物谱及资源分配，结果表明尽管两种捕食者不存在种间捕食，但食物网分析和Ｐｉａｎｋａ生态位重叠指数表明这两种捕食者存在很高程度的猎物重叠和较强的猎物资源竞争，清除外来入侵的鼩鼱应是保护蜥蜴的首要措施㊂蝙蝠是许多农林及卫生害虫的天敌，也是种子的传播者和花粉的传授者，在生态系统占据独特的生存空间，因此研究和保护蝙蝠在维护生态环境中具有十分重要的意义㊂Ｃｌａｒｅ等［３５］基于ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭ测序平台，结合３１６芯片研究了加拿大安大略省剑桥市郊森林斑块大棕蝠Ｅｐｔｅｓｉｃｕｓｆｕｓｃｕｓ不同时间猎物的多样性及猎物转换，表明大棕蝠对甲虫捕食率最高，其猎物谱中鳞翅目具有最高的多样性，猎物种类组成在不同年份和季节变化很大，但鳞翅目和蜉蝣目是其恒定的猎物成分，猎物多样性随着昆虫多样性的减少而增加㊂这说明当猎物资源有限时，大棕蝠可以改变摄食策略以维持其生态稳定性㊂２．２㊀植食性脊椎动物海岛为许多濒危鸟类提供了栖息环境，但是对外来物种可能是脆弱的生态系统㊂Ａｎｄｏ等［３６］通过扩增植物叶绿体ｔＲＮＡＬ（ｔｒｎＬ）基因条形码结合Ｒｏｃｈｅ４５４焦磷酸测序研究了日本小笠原诸岛濒危黑林鸽Ｃｏｌｕｍｂａｊａｎｔｈｉｎａｎｉｔｅｎｓ在不同岛屿和不同时间的食物谱及食物转换，结果发现黑林鸽更喜欢取食外来植物，因此建议在清除外来植物和保护本岛植物之间应该有个权衡，以保持黑林鸽的食物资源㊂人类活动造成的森林景观碎片化极大地影响了灵长类动物的栖息㊂Ｑｕéｍéｒé等［３７］利用ＩｌｌｕｍｉｎａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘ平台结合ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ技术对马达加斯加岛达赖纳地区濒临灭绝的金冠冕狐猴Ｐｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓｔａｔｔｅｒｓａｌｌｉ的食性进行研究，发现金冠冕狐猴的食谱里至少有１３０种植物，并且在森林边缘生活的金冠冕狐猴食物中发现许多栽培和野生的植物种类，表明多样性的食谱有利于狐猴灵活改变食物结构应对栖息地的改变和环境的变化㊂Ｋａｒｔｚｉｎｅｌ等［３０］通过ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００平台结合ＤＮＡＭｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ技术，应用相对读长丰度（ＲｅｌａｔｉｖｅＲｅａｄＡｂｕｎｄａｎｃｅ，ＲＲＡ）比较研究了肯尼亚南部非洲热带稀树草原艮氏小羚Ｍａｄｏｑｕａｇｕｅｎｔｈｅｒｉ，非洲象Ｌｏｘｏｄｏｎｔａａｆｒｉｃａｎａ，平原斑马Ｅｑｕｕｓｑｕａｇｇａ，细纹斑马Ｅｑｕｕｓｇｒｅｖｙｉ，非洲水牛Ｓｙｎｃｅｒｕｓｃａｆｆｅｒ，瘤牛Ｂｏｓｉｎｄｉｃｕｓ和高角羚Ａｅｐｙｃｅｒｏｓｍｅｌａｍｐｕｓ等７种大型食草动物的食谱宽度㊁组成和重叠度㊂研究表明，食草的两种斑马食物中９９％以上的序列都是禾本科植物，而食嫩叶的艮氏小羚食物中禾本科植物却不足１％，同一种食草动物食物谱相似，而不同种食草动物具有更加分化的食物谱，因此植物种类的多样性为维持非洲草原食物谱分化的大型食草动物的多样性奠定了基础㊂２．３㊀捕食性无脊椎动物Ｂｏｙｅｒ等［３８］应用Ｒｏｃｈｅ４５４焦磷酸测序技术结合蚯蚓的组特异性引物研究了４６头濒危的软体动物蜗牛Ｐｏｗｅｌｌｉｐｈａｎｔａａｕｇｕｓｔａ捕食蚯蚓的食物谱，分析了蜗牛与不同生物学特性蚯蚓的生态联系，并提出了保护迁移蜗牛的建议㊂评价农业生态系统中捕食性天敌对害虫的控制作用是生态学研究的重要课题，也是实施害虫综合治理防治策略的基础㊂研究农业生态系统内某种捕食者是否影响目标猎物的种群动态，并不能仅仅简单地通过捕食者的捕食率来计算㊂Ｐｉñｏｌ等［３９］通过ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭ测序平台研究了英国燕麦田皿蛛Ｏｅｄｏｔｈｏｒａｘｆｕｓｃｕｓ的猎物谱，高通量测序生成２００万条读长，去掉无效和捕食者本身读长，剩下６万多条有效读长，有效读长中比较丰富的是弹尾目㊁鳞翅目㊁双翅目和线虫的序列，也包含了蚜虫和集团内捕食（ＩｎｔｒａｇｕｉｌｄＰｒｅｄａｔｉｏｎ，ＩＧＰ）而残留的蜘蛛的序列㊂结果表明，广食性天敌皿蛛Ｏ．ｆｕｓｃｕｓ具有宽广的猎物谱㊂通过提高种植园植物多样性，为广食性捕食者提供替代猎物，以增加捕食者的密度来增强天敌对农业害虫的自然调控作用，是生态调控农业生产的重要组成部分㊂Ｍｏｌｌｏｔ等［４０］基于构建香蕉园节肢动物ｍｉｎｉ⁃ｂａｒｃｏｄｅｓ数据库和Ｒｏｃｈｅ４５４高通量测序平台，通过建立种植牧草伏生臂形草Ｂｒａｃｈｉａｒｉａｄｅｃｕｍｂｅｎｓ的香蕉园和对照园比较的方式，比较了两种类型实验田捕食性天敌的猎物选择及对主要害虫香蕉象甲Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓｓｏｒｄｉｄｕｓ控制作用㊂结果表明因为广食性捕食者转向捕食替换猎物，香蕉园种植牧草对天敌调控害虫种群可能有负作用㊂２．４㊀植食性无脊椎动物Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ等［４１］设计了扩增植物叶绿体ｔＲＮＡＬ（ｔｒｎＬ）基因条形码的通用引物，结合Ｒｏｃｈｅ４５４测序研究了异色雏蝗Ｃｈｏｒｔｈｉｐｐｕｓｂｉｇｕｔｔｕｌｕｓ，北京棒角蝗Ｇｏｍｐｈｏｃｅｒｉｐｐｕｓｒｕｆｕｓ，智利螺旋蜗牛Ｈｅｌｉｘａｓｐｅｒｓａ，鼻涕虫Ｄｅｒｏｃｅｒａｓｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ和Ａｒｉｏｎａｔｅｒ等动物的３６份粪便样品，解析了这些植食性动物的食物谱，结果表明大约５０％的植物可以鉴定到种，这也是宏条形码技术在植食性动物食物研究中的第一次应用，为研究植食性动物食物谱和资源分配提供了切实可行的方法㊂Ｋａｊｔｏｃｈ［４２］通过ＡＢＩＳａｎｇｅｒ测序和高通量测序平台ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ解析了波兰中南部㊁波兰北部㊁乌克兰西部和斯洛伐克⁃摩拉维亚地区四个地理种群干热象甲Ｃｅｎｔｒｉｃｎｅｍｕｓｌｅｕｃｏｇｒａｍｍｕｓ寄主植物的ｒｂｃＬ（１，５⁃二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基基因）和ｔｒｎＬ两种基因的条形码，比较了这两种测序技术对基于ｒｂｃＬ和ｔｒｎＬ两种基因条形码的寄主植物解析深度，并分析了这４个地理种群的寄主植物范围㊂研究表明Ｉｌｌｕｍｉｎａ高通量测序比Ｓａｎｇｅｒ传统测序具有更详尽的解析度；并且，基于ｒｂｃＬ和ｔｒｎＬ双基因条形码系统能为研究植食者的寄主植物（至少鉴定到属）提供足够的信息；４个不同地理种群的干热象甲食物谱并不相同，这可能反应了干热象甲的地理种群的生态适应和遗传隔离，为保护稀有和濒危物种提供了借鉴㊂研究直翅目昆虫单食性到广食性的宽广食物谱有助于我们探究植食性昆虫食性的分化和进化㊂通常认为蝗科的北方绿带蝗Ｃｈｏｒｔｏｐｈａｇａｖｉｒｉｄｉｆａｓｃｉａｔａ是禾草性植食者，赤腿蝗Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ是杂草性植食者，而黑带双蝗Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ和卡罗来纳蝗Ｄｉｓｓｏｓｔｅｉｒａｃａｒｏｌｉｎａ是混合性植食者㊂ＭｃＣｌｅｎａｇｈａｎ等［４３］基于ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ平台通过扩增野外采集的这４种蝗虫的消化道内容物的ｒｂｃＬ基因，运用ＤＮＡｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ技术研究了这四种蝗虫的食性㊂结果证实黑带双蝗和卡罗来纳蝗是混合性植食者，北方绿带蝗是禾草性植食者，而赤腿蝗消化道内既有杂草也有禾本科植物，揭示了这些蝗虫种间存在食物资源竞争㊂５３５２㊀８期㊀㊀㊀王雪芹㊀等：高通量测序及其在食物网解析中的应用进展㊀６３５２㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３７卷㊀３㊀总结与展望３．１㊀存在的问题㊀㊀尽管近年来基于高通量测序技术的ＤＮＡｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ技术解决了全面分析捕食者／植食者食物链和食物网的技术障碍，从而发展成为分子生态学研究中一个十分活跃的领域，但是其结果的可靠性仍受多方面因素的影响：（１）目的基因的选择㊀细胞内多拷贝的动物线粒体基因组和植物叶绿体基因组具有保守的结构和大小，因此适合作为动物分子鉴定和植物分子鉴定的标记［４４⁃４５］㊂但是，动物体的线粒体基因组转移至细胞核的线粒体假基因（ＮｕｃｌｅａｒＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ⁃ｌｉｋｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＮＵＭＴｓ）㊁内共生菌干扰㊁线粒体ＤＮＡ的多态性和异质性可影响物种的鉴定和系统发育的构建［４６⁃４７］㊂（２）基因区域的选择㊀动物线粒体基因组ＤＮＡ主要选择在ＣＯＩ，１６Ｓ等区域，而ＣＯＩ的６５８ｂｐ长的ＤＮＡ条形码（ＤＮＡＢａｒｃｏｄｉｎｇ）区域是动物分类鉴定最常用的区域［４８⁃４９］，也具有包括ＮＣＢＩ和ＢＯＬＤ（ｗｗｗ．ｂｏｌｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｏｒｇ）等丰富的数据库资源［５０］，但ＣＯＩ基因进化速率的差异使其在一些类群中缺乏鉴定能力，因此有时需要多基因条形码鉴定系统［５１］㊂同时，植物叶绿体ＤＮＡ主要选择在ｒｂｃＬ，ｍａｔＫ（叶绿体赖氨酸基因（ｔｒｎＫ）的内含子），ｔｒｎＨ⁃ｐｓｂＡ３个条形码片段及近来发现的植物核糖体ＩＴＳ条形码片段，同样对于困难类群，很多学者建议使用多个条形码协同鉴定［５２⁃５３］㊂（３）引物的选择和评估㊀由于消化道残留或粪便是降解的短片段ＤＮＡ，因此ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ分析其多样性时常用兼并的扩增短片段的通用引物，而通用引物的选择或组合㊁扩增偏向性㊁扩增成功率和扩增片段的分辨率等都会导致稀有的或者难扩增物种的数据丢失或失真等错误，从而影响到对捕食者和植食者与其食物间数量关系的解析，因而尚需在进一步明确这些因素与扩增效率关系的基础上完善食物网关系的定量分析方法［１３，５４⁃５５］㊂（４）阻止扩增捕食者本身的特异性阻断引物（Ｂｌｏｃｋｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓ）的使用㊀研究未解剖小型捕食性节肢动物的猎物时，未添加阻断引物的情况下，会产生大量捕食者本身的序列，有时即使在阻断引物存在的情况下，也未必能保证阻止成功［３９，５６⁃５７］㊂（５）公共数据平台ＤＮＡ条形码参考数据库的不尽完善㊀生物ＤＮＡ条形码是建立在物种形态分类基础上的分子鉴定，生物形态特征的可塑性和遗传多样性直接影响基于传统形态分类的生物鉴定，而当前训练有素的分类学家越来越少，形态分类学工作又不可避免地会遇到人为的错误及其他无法克服的困难，因此形态分类和系统分类的发展研究水平将直接影响物种的传统分类鉴定，进而影响其构建物种ＤＮＡ条形码标准数据库㊁物种信息库㊁信息共享和应用［５８⁃５９］㊂（６）生物信息学专家和人才的短缺㊀高通量测序技术产生的海量数据的整合和分析在生物研究中发挥着关键作用，而动物食物网海量数据的分子解析不仅需要前期生态学㊁分类学工作者的基础工作，更需要后期生物信息学工作者的储存㊁检索㊁处理和分析以揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生态学奥秘［６０］㊂３．２㊀展望从复杂的野外观察㊁摄像到室内的消化道内容物解剖分析，从脂肪酸㊁同位素标记的生化分析到猎物蛋白特异的抗体技术，从普通ＰＣＲ㊁定量ＰＣＲ再到基于高通量测序的宏条形码技术，捕食性和植食性动物的食物链和食物网研究发展的每一步都离不开科学的发展和技术的创新［１２⁃１３，２５，６１⁃６２］㊂尽管基于高通量测序数据的ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ方法还存在一些问题，如扩增区域的选择㊁引物的选择或组合㊁ＰＣＲ的偏好性㊁扩增效率的差异㊁读长的清晰度或解析度和数据库的完善度等［６３⁃６５］，但随着高通量测序技术的发展和不断完善，尤其是测序通量的增加㊁读长的增长㊁信息储备量的增大㊁测序成本的降低㊁数据分析软件的优化以及生物条形码的发展和基因数据库资源的丰富［３，６６⁃６７］，特别是近年来发展的无偏见精确定量的ＰＣＲ⁃ｆｒｅｅ深度鸟枪法测序（Ｓｈｏｔ⁃ｇｕｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）［６８⁃７１］和线粒体捕获富集深度测序多样性评估技术［７２⁃７３］，都将为高通量㊁准确㊁快速和低成本的全面深入研究捕食性和植食性动物的食物网提供更理想的资源和平台，为进一步应用高通量测序探索捕食性和植食性动物的猎物／寄主范围㊁猎物／寄主转换㊁生物防治㊁资源分配㊁生物保护㊁生态工程等生态恢复提供技术支撑和理论基础［２７⁃２８，３０］㊂参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：［１］㊀ＳａｎｇｅｒＦ，ＡｉｒＧＭ，ＢａｒｒｅｌｌＢＧ，ＢｒｏｗｎＮＬ，ＣｏｕｌｓｏｎＡＲ，ＦｉｄｄｅｓＪＣ，ＨｕｔｃｈｉｓｏｎＩＩＩＣＡ，ＳｌｏｃｏｍｂｅＰＭ，ＳｍｉｔｈＭ．ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅφＸ１７４ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ，１９７７，２６５（５５９６）：６８７⁃６９５．［２］㊀ＳａｎｇｅｒＦ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，５７：１⁃２８．［３］㊀ＧｌｅｎｎＴＣ．Ｆｉｅｌｄｇｕｉｄｅｔｏｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，２０１１，１１（５）：７５９⁃７６９．［４］㊀ＰａｎＱ，ＳｈａｉＯ，ＬｅｅＬＪ，ＦｒｅｙＢＪ，ＢｌｅｎｃｏｗｅＢＪ．Ｄｅｅｐｓｕｒｖｅｙｉｎｇｏｆａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｂｙｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，４０（１２）：１４１３⁃１４１５．［５］㊀ＴａｂｅｒｌｅｔＰ，ＣｏｉｓｓａｃＥ，ＨａｊｉｂａｂａｅｉＭ，ＲｉｅｓｅｂｅｒｇＬＨ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＤＮＡ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２１（８）：１７８９⁃１７９３．［６］㊀ＢｏｈｍａｎｎＫ，ＥｖａｎｓＡ，ＧｉｌｂｅｒｔＭＴＰ，ＣａｒｖａｌｈｏＧＲ，ＣｒｅｅｒＳ，ＫｎａｐｐＭ，ＹｕＤＷ，ｄｅＢｒｕｙｎＭ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＤＮＡｆｏｒｗｉｌｄｌｉｆｅｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．ＴｒｅｎｄｓｉｎＥｃｏｌｏｇｙ＆Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１４，２９（６）：３５８⁃３６７．［７］㊀ＴａｂｅｒｌｅｔＰ，ＣｏｉｓｓａｃＥ，ＰｏｍｐａｎｏｎＦ，ＢｒｏｃｈｍａｎｎＣ，ＷｉｌｌｅｒｓｌｅｖＥ．Ｔｏｗａｒｄｓｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｕｓｉｎｇＤＮＡｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２１（８）：２０４５⁃２０５０．［８］㊀ＹｕＤＷ，ＪｉＹＱ，ＥｍｅｒｓｏｎＢＣ，ＷａｎｇＸＹ，ＹｅＣＸ，ＹａｎｇＣＹ，ＤｉｎｇＺＬ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｓｏｕｐ：ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇｏｆａｒｔｈｒｏｐｏｄｓｆｏｒｒａｐｉｄｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄｂｉｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１２，３（４）：６１３⁃６２３．［９］㊀ＪｉＹＱ，ＡｓｈｔｏｎＬ，ＰｅｄｌｅｙＳＭ，ＥｄｗａｒｄｓＤＰ，ＴａｎｇＹ，ＮａｋａｍｕｒａＡ，ＫｉｔｃｈｉｎｇＲ，ＤｏｌｍａｎＰＭ，ＷｏｏｄｃｏｃｋＰ，ＥｄｗａｒｄｓＦＡ，ＬａｒｓｅｎＴＨ，ＨｓｕＷＷ，ＢｅｎｅｄｉｃｋＳ，ＨａｍｅｒＫＣ，ＷｉｌｃｏｖｅＤＳ，ＢｒｕｃｅＣ，ＷａｎｇＸＹ，ＬｅｖｉＴ，ＬｏｔｔＭ，ＥｍｅｒｓｏｎＢＣ，ＹｕＤＷ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ，ｖｅｒｉｆｉａｂｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｖｉａｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ．ＥｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１３，１６（１０）：１２４５⁃１２５７．［１０］㊀罗亚皇，刘杰，高连明，李德铢．ＤＮＡ条形码在生态学研究中的应用与展望．植物分类与资源学报，２０１３，３５（６）：７６１⁃７６８．［１１］㊀ＲｏｓｓｂｅｒｇＡＧ．ＦｏｏｄＷｅｂｓａｎｄＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ，Ｍｏｄｅｌｓ，Ｄａｔａ．ＵＫ：ＷｉｌｅｙＢｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１３．［１２］㊀ＫｉｎｇＲＡ，ＲｅａｄＤＳ，ＴｒａｕｇｏｔｔＭ，ＳｙｍｏｎｄｓｏｎＷＯＣ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｅｄａｔｉｏｎ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｂｅｓｔｐｒａｃｔｉｃｅｆｏｒＤＮＡ⁃ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００８，１７（４）：９４７⁃９６３．［１３］㊀ＰｏｍｐａｎｏｎＦ，ＤｅａｇｌｅＢＥ，ＳｙｍｏｎｄｓｏｎＷＯＣ，ＢｒｏｗｎＤＳ，ＪａｒｍａｎＳＮ，ＴａｂｅｒｌｅｔＰ．Ｗｈｏｉｓｅａｔｉｎｇｗｈａｔ：ｄｉｅｔａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｕｓｉｎｇｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２１（８）：１９３１⁃１９５０．［１４］㊀ＳｅｏＴＳ，ＢａｉＸＰ，ＫｉｍＤＨ，ＭｅｎｇＱＬ，ＳｈｉＳＤ，ＲｕｐａｒｅｌＨ，ＬｉＺＭ，ＴｕｒｒｏＮＪ，ＪｕＪＹ．Ｆｏｕｒ⁃ｃｏｌｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｎａｃｈｉｐｕｓｉｎｇｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００５，１０２（１７）：５９２６⁃５９３１．［１５］㊀闫绍鹏，杨瑞华，冷淑娇，王秋玉，周容涛．高通量测序技术及其在农业科学研究中的应用．中国农学通报，２０１２，２８（３０）：１７１⁃１７６．［１６］㊀ＭｏｒｅｙＭ，Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ⁃ＭａｒｍｉｅｓｓｅＡ，ＣａｓｔｉñｅｉｒａｓＤ，ＦｒａｇａＪＭ，ＣｏｕｃｅＭＬ，ＣｏｃｈｏＪＡ．Ａｇｌｉｍｐｓｅｉｎｔｏｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄｆｕｔｕｒｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０１３，１１０（１／２）：３⁃２４．［１７］㊀ＭａｒｇｕｌｉｅｓＭ，ＥｇｈｏｌｍＭ，ＡｌｔｍａｎＷＥ，ＡｔｔｉｙａＳ，ＢａｄｅｒＪＳ，ＢｅｍｂｅｎＬＡ，ＢｅｒｋａＪ，ＢｒａｖｅｒｍａｎＭＳ，ＣｈｅｎＹＪ，ＣｈｅｎＺＴ，ＤｅｗｅｌｌＳＢ，ＤｕＬ，ＦｉｅｒｒｏＪＭ，ＦｏｒｔｅＲ，ＧｏｍｅｓＸＶ，ＧｏｄｗｉｎＢＣ，ＨｅＷ，ＨｅｌｇｅｓｅｎＳ，ＨｏＣＨ，ＨｕｔｃｈｉｓｏｎＳＫ，ＩｒｚｙｋＧＰ，ＪａｎｄｏＳＣ，ＡｌｅｎｑｕｅｒＭＬＩ，ＪａｒｖｉｅＴＰ，ＪｉｒａｇｅＫＢ，ＫｉｍＪＢ，ＫｎｉｇｈｔＪＲ，ＬａｎｚａＪＲ，ＬｅａｍｏｎＪＨ，ＬｅｅＷＬ，ＬｅｆｋｏｗｉｔｚＳＭ，ＬｅｉＭ，ＬｉＪ，ＬｏｈｍａｎＫＬ，ＬｕＨ，ＭａｋｈｉｊａｎｉＶＢ，ＭｃＤａｄｅＫＥ，ＭｃＫｅｎｎａＭＰ，ＭｙｅｒｓＥＷ，ＮｉｃｋｅｒｓｏｎＥ，ＮｏｂｉｌｅＪＲ，ＰｌａｎｔＲ，ＰｕｃＢＰ，ＲｅｉｆｌｅｒＭ，ＲｏｎａｎＭＴ，ＲｏｔｈＧＴ，ＳａｒｋｉｓＧＪ，ＳｉｍｏｎｓＪＦ，ＳｉｍｐｓｏｎＪＷ，ＳｒｉｎｉｖａｓａｎＭ，ＴａｒｔａｒｏＫＲ，ＴｏｍａｓｚＡ，ＶｏｇｔＫＡ，ＶｏｌｋｍｅｒＧＡ，ＷａｎｇＳＨ，ＷａｎｇＹ，ＷｅｉｎｅｒＭＰ，ＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙＤＡ，ＹｕＰＧ，ＢｅｇｌｅｙＲＦ，ＲｏｔｈｂｅｒｇＪＭ．Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄｈｉｇｈ⁃ｄｅｎｓｉｔｙｐｉｃｏｌｉｔｒｅｒｅａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３７（７０５７）：３７６⁃３８０．［１８］㊀ＺｈｏｕＸＧ，ＲｅｎＬＦ，ＬｉＹＴ，ＺｈａｎｇＭ，ＹｕＹＤ，ＹｕＪ．Ｔｈｅｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｖｉｅｗａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１０，５３（１）：４４⁃５７．［１９］㊀ＥｓｃａｌａｎｔｅＡＥ，ＢａｒｂｏｌｌａＬＪ，Ｒａｍíｒｅｚ⁃ＢａｒａｈｏｎａＳ，ＥｇｕｉａｒｔｅＬＥ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｅｒａｏｆｍａｓｓｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＲｅｖｉｓｔａＭｅｘｉｃａｎａｄｅＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｄａｄ，２０１４，８５（４）：１２４９⁃１２６４．［２０］㊀ＦｌｕｓｂｅｒｇＢＡ，ＷｅｂｓｔｅｒＤＲ，ＬｅｅＪＨ，ＴｒａｖｅｒｓＫＪ，ＯｌｉｖａｒｅｓＥＣ，ＣｌａｒｋＴＡ，ＫｏｒｌａｃｈＪ，ＴｕｒｎｅｒＳＷ．ＤｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｉｎｇｌｅ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，２０１０，７（６）：４６１⁃４６５．［２１］㊀ＩｖａｎｏｖＡＰ，ＩｎｓｔｕｌｉＥ，ＭｃＧｉｌｖｅｒｙＣＭ，ＢａｌｄｗｉｎＧ，ＭｃＣｏｍｂＤＷ，ＡｌｂｒｅｃｈｔＴ，ＥｄｅｌＪＢ．ＤＮＡｔｕｎｎｅｌｉｎｇｄｅｔｅｃｔｏｒｅｍｂｅｄｄｅｄｉｎａｎａｎｏｐｏｒｅ．ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ，２０１１，１１（１）：２７９⁃２８５．［２２］㊀朱艳慧，贺树香，王晓春，胡朝晖．通往个性化医疗的新一代测序技术：ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ．生物技术通讯，２０１３，２４（４）：５８７⁃５９１．［２３］㊀ＤｅｌＣｈｉｅｒｉｃｏＦ，ＡｎｃｏｒａＭ，ＭａｒｃａｃｃｉＭ，ＣａｍｍàＣ，ＰｕｔｉｇｎａｎｉＬ，ＣｏｎｔｉＳ．Ｃｈｏｉｃｅｏｆｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／／ＭｅｎｇｏｎｉＡ，ＧａｌａｒｄｉｎｉＭ，ＦｏｎｄｉＭ，ｅｄｓ．ＢａｃｔｅｒｉａｌＰａｎｇｅｎｏｍｉｃｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１５：３１⁃４７．［２４］㊀张得芳，马秋月，尹佟明，夏涛．第三代测序技术及其应用．中国生物工程杂志，２０１３，３３（５）：１２５⁃１３１．７３５２㊀８期㊀㊀㊀王雪芹㊀等：高通量测序及其在食物网解析中的应用进展㊀。
高通量测序技术的应用与数据分析研究
高通量测序技术的应用与数据分析研究随着生物技术的快速发展和大规模基因测序项目的推进，高通量测序技术已成为现代生物医学研究的关键工具之一。
高通量测序技术可以高效、准确地测定基因组和转录组中的DNA和RNA序列，对于研究基因功能、疾病发生机制以及个体间的遗传差异等都具有重要意义。
本文将重点介绍高通量测序技术的应用和数据分析研究。
高通量测序技术（high-throughput sequencing technology）又被称为第二代测序技术，它以其高效高通量的特点革命性地改变了生物学研究的方式。
在过去，Sanger测序技术是主要的测序方法，但其费时费力且低通量的特点限制了其在大规模测序项目中的应用。
与此相比，高通量测序技术具有高度自动化、高通量和较低成本的特点，使得大规模测序项目变得可行且经济可行。
高通量测序技术的应用非常广泛，涵盖了从基因组学、转录组学到表观基因组学等多个研究领域。
在基因组学研究中，高通量测序技术可以用于对生物体的基因组进行全面测序，以了解其基因组结构、基因组变异和基因组演化等信息。
在转录组学研究中，高通量测序技术可以通过RNA测序（RNA-seq）分析细胞或组织中的所有转录本，从而揭示基因表达调控机制、发现新的转录本并研究它们的功能。
在表观基因组学研究中，高通量测序技术可以用于甲基化测序（MeDIP-seq）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq），以研究DNA甲基化和染色质修饰与基因调控的关系。
高通量测序技术的数据分析对于产生准确、可靠的结果至关重要。
数据分析包括从原始测序数据中去除低质量的碱基、去除接头序列和质控过程等预处理步骤。
接下来，需要将测序得到的短序列（short reads）比对到参考基因组上，以确定其来源位置。
这一步骤通常使用比对算法（alignment algorithm），例如Bowtie、BWA等。
比对之后，需要进行位点覆盖度和覆盖度均匀性的评估，用于判断读取的深度是否足够，并检查是否存在PCR扩增偏差。
高通量测序技术及实用数据分析ppt课件
第三代测序：单分子测序
不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代 分子测序，不需要进行PCR扩增。
早在2008年，HelicoBio Science 公司的Harris等在Science上报道了他们开发的 TIRM（total internal reflection microscopy）测序技术。
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Ion Torrent测序技术：
使用半导体技术将生化反应与电流强度直接联系。在聚合酶反应时，每聚合 一个碱基会释放出相应的质子，引起周围环境PH的变化，将PH变化转化为 电流的变化，最终记录电流信号，获得测序序列。读长约200bp，根据芯片 不同可以一次产生10M-20G的数据。
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物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到
实时测定DNA序列的目的。
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Hiseq2000/Hiseq1000（HIseq2500/Hiseq1500）平台简介： 原理：基于DNA单分子簇边合成 ➢ 将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸
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常见的高通量测序测序平台
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焦磷酸测序技术：引物与模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP
sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引
• 每一个k-mer作为图中一个节点，两 个k-mer如果在同一read中相邻，则 形成一个边。
高通量基因测序技术及数据分析
高通量基因测序技术及数据分析随着科学技术的不断进步，基因测序技术也取得了巨大的突破。
高通量基因测序技术（high-throughput sequencing technology）是一种快速、精确、高效的测序技术，它可以大大缩短测序时间，降低成本，从而在基因研究领域取得重大突破。
高通量基因测序技术的原理是将DNA或RNA样品分为微小的片段，并在高通量测序仪中进行并行测序。
这种技术通过同时测序多个DNA片段，极大地提高了测序效率。
高通量测序技术可以应用于各种领域，包括基因组学、转录组学、表观遗传学和蛋白质组学等。
高通量基因测序技术主要有以下几种：Illumina测序技术、Ion Torrent测序技术、PacBio测序技术和Oxford Nanopore测序技术。
其中，Illumina测序技术是最常用的高通量测序技术之一。
它基于桥式PCR和碱基按键扩增（SBG）技术，可以快速、高效地获得大量的测序数据。
高通量基因测序技术的应用广泛。
在基因组学研究中，高通量测序技术可以用于对物种的全基因组进行测序，帮助研究人员了解物种的遗传变异、进化历程和功能等。
在转录组学研究中，高通量测序技术可以实现对整个基因组的转录本进行测序，从而揭示基因的表达模式和调控网络。
在表观遗传学研究中，高通量测序技术可以用于DNA甲基化和组蛋白修饰的检测，从而深入了解表观遗传学在基因调控中的作用。
在蛋白质组学研究中，高通量测序技术可以用于蛋白质质谱的分析，帮助鉴定蛋白质的序列和修饰。
高通量基因测序技术的数据分析是测序研究的重要环节之一。
在高通量测序实验中，产生的大量数据需要进行存储、处理和分析。
数据分析的主要目标是从原始测序数据中提取有用的信息。
高通量基因测序数据分析包括数据预处理、序列比对、SNP和InDel检测、基因表达分析、功能注释等步骤。
首先，数据预处理是数据分析的第一步，用于去除测序数据中的低质量读取、接头序列和重复序列。
高通量测序分析根结线虫对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响
高通量测序分析根结线虫对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响作者：张丽芳李艳琼蔡建高秀徐晴芳刘威良杨卫星胡海林来源：《福建农业学报》2021年第08期摘要：【目的】分析根結线虫对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响。
【方法】通过高通量测序技术、土壤性质测定及生物信息学技术分析感染根结线虫马铃薯和健康马铃薯根际土壤真菌群落多样性差异。
【结果】从6个土壤样品中共获得3界12门34纲77目171科332属526种的土壤真菌。
对物种多样性指数分析后，发现感染根结线虫马铃薯病株与健康马铃薯植株的根际土壤真菌群落多样性和土壤性质均存在显著性差异。
对6个样品进行物种组成分析后，在门水平中，感病植株根际土壤真菌Basidiomycota丰度较健康植株根际土壤真菌丰度高，Ascomycota丰度低于健康植株根际土壤;在科水平中，病株根际土壤丰度较高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae;在属水平中，健康植株根际土壤丰度较高的菌群为镰刀菌属Fusarium、被孢霉属Mortierella和未知分类毛壳菌科属unclassified_f_Chaetomiaceae。
【结论】感染根结线虫的马铃薯与健康马铃薯根际土壤真菌群落丰度在门、科和属水平上均存在差异，为进一步研究马铃薯根结线虫的发生和防治提供了新的思路。
关键词：根结线虫;马铃薯根际土壤;土壤性质;高通量测序;真菌多样性中图分类号：S154;S 532文献标志码：A文章编号：1008-03 84（2021）08-0936-06High-Throughput Sequencing on Fungal Diversity in Potato Rhizosphere SoilInfested by Root-knot NematodesZHANG Lifang 1， LI Yanqiong 2， CAI Jian 1. GAO Xiu 1， XU Qingfang 1. LIU Weiliang 1， YANG Weixing 1， HU Hailin 3*（I. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， Qujing Normal University，Qujing， Yunnan 65501I， China; 2. Collegeof Agronomy and Life Sciences， Kunming University Kunming， Yunnan 6502 14. China; 3. College of Mathematics andStatistics， Qujing Normal University Qujing， Yunnan 65501I. China ）Abstract：【Objective】Diversity of the thizosphere soil fungal community in potato field as affected by the presence of root-knot nematodes was investigated using high-throughput sequencing technique. 【Methods】The properties and bioinformaticsof thizosphere soils surrounding healthy and infested potato plants were compared to analyze the possible effects of differentialfungal community on the occurrence and control of the disease. 【Results】There were 526 fungi species belonging t0 332genera. 171 families. 77 0rders. 34 classes， 12 phyla， and 3 kingdoms identified from the 6 field specimens. Significantlydifferentiations on the fungal community diversity and properties of the thizosphere soils on the healthy and infested potato lotswere found. In the infected areas， Basidiomycota was the more abundant phylum， but Ascomycota less， than on the healthy lots.At family level. Nectriaceae and Trimorphomycetaceae were more abundantly found in the soil of diseased plants， while atgenus level， Fusarium. Mortierella， and some unclassified Chaetomiaceae more richly in the soil of healthy plants.【Conclusion】Significant differences in the abundance of fungi in the thizosphere soils of potatoes infested by the root-knotnematodes and the healthy counterparts were found at phylum， family， and genus levels. The information would aid furtherstudy on the occurrence and control of potato root-knot nematodes.Key words： Root-knot nematodes; potato thizosphere soils; soil properties; high throughout sequencing technology; fungidiversity0 引言【研究意义】马铃薯Solanum tuberosum L隶属茄科茄属，是世界上第四大粮食作物，是云南省三大粮食作物之一，据云南省农业农村厅统计数据显示，截至2018年底，云南省马铃薯种植面积达5.628×10s hm2，产量（折粮）209.2万t，云南省马铃薯种植面积、总产量均居全国第3位，同时也是根结线虫的主要寄主之一。
【华中农业大学动科学院】-从“单一”组学到“多组学”——高通量测序与贯穿分析V1
张羽 2014/9 yzhang@
1
背景
转录组测序
数据
数 据 分 析
mRNA水平 目标基因
表达差异分析 基因表达趋势分析 共表达网络分析
…….
2
DNA信息
基因组de novo 测序 重测序 RAD测序 Meta测序
40
蓖麻项目待解决的问题
留下思考的问题： 1）子代甲基化状态是否遗传自亲本？
解决方案：亲本甲基化测序； 2）种子在丌同发育阶段的甲基化是否发生变化，如何受到其他组
学的调控（例如，RdDM） 解决方案：增加时间点 + 小RNA测序 + 贯穿
3）蓖麻的甲基化调控有什么特点，是类似玉米（含大量转座子） or 拟南芥？ 解决方案：多组学贯穿 + 比较基因组
测序策略：全基因组BS、表达谱、 小RNA
研究目的：
1）siRNA对甲基化的调控方式；
2）CHH在转录组调控中的作用；
三种组学分别定量 整合
基因区上下 游附近分析
TE区分析
Jonathan I. GentGenome Res. 2013 23: 628-637
43
主要发现
1. siRNA介导的DNA甲基化（RdDM） 在基因区富集 1）siRNA在基因区附近富集； 2）基因区附近的CHH甲基化上调； 3）基因表达量不CHH甲基化正相关；
150
100
50
0 2009
2010
2011
2012
2013
2014
转录组和蛋白贯穿文章检索
检索词：((transcriptome[Title/Abstract]) OR transcript[Title/Abstract]) AND ((proteome[Title/Abstract]) OR proteomics[Title/Abstract])
基因组学的高通量数据分析
基因组学的高通量数据分析随着高通量测序技术的不断发展，基因组学已经成为生命科学领域中的一个重要的研究方向。
基因组学研究主要集中在对基因序列和基因表达的探究，通过对生物的基因组进行全面的研究，可以帮助科学家了解生命的本质，以及生命出现和进化的原因。
在基因组学的研究中，高通量数据分析扮演着重要角色。
高通量测序技术的出现，为生物大数据分析提供了越来越多的数据来源。
基因组学的数据分析技术和方法也在不断发展和改进。
基因组学的高通量数据分析包括基因组测序、转录组测序、蛋白质组学、代谢组学等各个领域的数据分析，对于基因组的研究提供了强有力的支持。
在基因组学的高通量数据分析中，最广泛应用的分析方法是基于多组学的方法。
这种方法通过整合多组学的数据，包括基因组、转录组、表观组、蛋白质组、代谢组等不同层次的数据，来对生物体质量、生命过程和疾病的发生机理进行更全面的解析。
这样的方法能够更准确地找到特定基因或某一生物过程的变化，以及在基因水平和表观基因水平上的特定作用。
从数据处理的角度来讲，基因组学的高通量数据分析也面临着大量的挑战。
基因组学数据的体积非常大，需要大量的计算资源和计算能力来进行处理和分析。
数据方面还存在诸多问题，如信噪比、序列错误率、序列质量、序列长度等。
因此，分析人员需要准确地清洗和处理数据，以确保数据的可靠性。
高通量数据分析包括了大量的要素，从实验设计、实验操作到数据收集和分析方法等等。
对于实验设计来说，重点是根据需要选择合适的技术平台，并且考虑样品处理的前后干扰情况。
实验操作需要确保样本纯度，使用标准实验操作的方法，以确保数据的重现性。
数据的处理和分析需要选择合适的算法和统计模型，并且进行有效的数据可视化，使得结果更加清晰和易于理解。
基因组学的高通量数据分析也有一些常用的软件和工具，如BLAST、CLUSTALW、PhyML、RAxML、MrBayes等等。
这些工具可以用于基于序列的DNA和蛋白质序列比对和进化分析。
基于高通量测序技术的组学数据分析方法研究
基于高通量测序技术的组学数据分析方法研究随着基因组学和生物信息学的发展，测序技术已经成为了研究生物学的重要工具。
高通量测序技术是其中一种重要的技术手段，它能够快速地产生大量的序列数据，大大提高了生物学研究的效率和深度。
然而，高通量测序技术产生的原始数据量巨大，需要进行大量的数据分析和处理才能得到有用的信息，因此，研究高通量测序技术的组学数据分析方法显得非常重要。
一、高通量测序技术简介高通量测序技术主要包括Illumina、Ion Torrent和PacBio等多种技术。
其中Illumina技术是目前应用最为广泛的技术之一，它基于DNA扩增法、桥式扩增法和测序反应体系，可以产生数千万条长度较短的读长（read），每条read长度通常在50到300bp之间。
这些短读长可以覆盖大部分基因组的区域，对基因重复区、SNP检测、插入/缺失/转座子的检测等方面的研究有重要的应用价值。
另一方面，Ion Torrent和PacBio等技术则能够产生更长的读长，为研究基因组结构和功能提供了更好的平台。
二、基于高通量测序技术的组学数据分析方法1.序列质量控制与过滤在高通量测序中，由于硬件和化学等多种因素的存在，测序数据常常包含有大量的噪音和错误，因此需要进行序列的质量控制和过滤。
常见的序列质量控制方法包括去除低质量序列、去除纯的重复序列、去除低复杂度序列和去除残留接头等。
2.基因组组装与注释基因组组装是高通量测序技术的重要应用之一，它能够将大量的序列数据拼接成更长的连片DNA序列。
基因组组装的主要难点在于不同的测序技术会导致不同的reads覆盖深度、覆盖度和错误率，因此需要选择合适的组装工具进行组装。
基因组注释则是对组装好的基因组序列进行注释，包括基因预测、功能注释、通路分析和转录本分析等多个方面。
3.转录组分析转录组分析是研究基因表达的重要手段之一，它能够通过分析RNA-seq数据，了解基因在不同组织和条件下的表达模式、剪接模式和调控机制等信息。
基于大数据的微生物高通量测序
基于大数据的微生物高通量测序文/章玉鲜，申铁*（贵州省信息与计算科学重点实验室，贵州贵阳 550001）摘要：为了探究生活垃圾对其周围土壤中微生物物种、群落组成及丰富度等的影响，实验研究采集了贵阳市某一垃圾填埋场内的伴生土壤、垃圾填埋场近距离土壤、远距离对照土壤进行检测分析。
实验基于Illumina Novaseq6000高通量测序平台分析微生物多样性，利用Silva、Unite、NCBI等数据库进行分析。
结果表明：3组土壤中的微生物物种多样性都比较丰富，Latescibacteria和Nitrospirae是垃圾填埋场伴生土壤中没有的，未见Rokubacteria。
实验结果可以为垃圾渗滤液对土壤中微生物的多样性影响提供数据参照和理论指导。
关键词：大数据分析；土壤微生物；Illumina Novaseq高通量测序1.实验部分1.1 Illumina Novaseq 6000高通量测序随着生物信息学科的兴起，高通量测序成为大数据分析方式中高效的分析测序方法，有利于相关部门高效快捷地得到所需数据。
例如，我们将采集的样品送往青岛市百迈客生物测序公司进行Illumina Novaseq 6000高通量测序，具体操作如下：首先将样品进行DNA提取，按照实验设计获得相应的引物，并且在引物的最后位置加上所需要的测序接头，在对引物进行PCR扩增后进行提纯检验和使用量的定值设置，进而形成最终的测序文库。
测序文库也要经过质量检查才能进行最终的测序。
1.2大数据结合下的生物数据伴随着高通量技术发展而产生的海量多元组学数据，为生物信息学的快速发展提供了丰富的数据资源。
实验基于大数据分析，基于binary jaccard、bray curtis、(u n) weighted unifrac（限细菌）多种算法展示测序物种的多样性并形成可视化的矩阵。
分析主坐标并进行可视化展现，以及受到哪些环境因子影响、与该样本中的组成间相关性如何等的分析算法，使用的都是排序分析。