医学细菌的形态学检查
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查是微生物学中非常重要的一部分，它可以帮助
我们了解细菌的形态特征，有助于诊断和治疗疾病。
在细菌形态学
检查中，染色方法是一项关键的技术，它可以使细菌在显微镜下更
容易观察和分辨。
以下是几种常用的细菌染色方法：
1. 革兰氏染色法，革兰氏染色法是最常用的细菌染色方法之一。
它可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
在这种染色方法中，先用紫普鲁士蓝染色，然后用碘液固定，再用酒精脱色，最后
用洋红染色。
革兰氏阳性细菌会呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性细菌
则会呈粉红色。
2. 厌氧染色法，厌氧染色法是专门用于观察厌氧菌的染色方法。
它与革兰氏染色法类似，但在脱色步骤中使用氢氟酸而不是酒精，
这样可以更好地保留厌氧菌的形态特征。
3. 阳性染色法，阳性染色法用于观察细菌的细胞壁结构和形态
特征。
在这种染色方法中，通常使用甲基蓝或结晶紫等染料，可以
使细菌呈现出蓝色或紫色。
4. 阴性染色法，阴性染色法也是用于观察细菌细胞壁结构和形态特征的一种方法。
与阳性染色法不同的是，阴性染色法使用印度墨染料，可以使细菌呈现出浅红色或粉红色。
除了上述列举的染色方法外，还有许多其他特殊的染色方法，如荧光染色、折射染色等，它们都可以根据需要来选择使用。
细菌形态学检查染色方法的选择取决于所研究的细菌种类、研究的目的以及实验室的设备和条件等因素。
希望这些信息可以帮助你更好地了解细菌形态学检查染色方法。
细菌的形态检查实验报告
细菌的形态检查实验报告细菌的形态检查实验报告引言：细菌是一类微小而广泛存在于自然界中的生物体，它们在生态系统中扮演着重要的角色。
为了更好地了解细菌的形态特征，我们进行了一项细菌形态检查实验。
本报告将详细介绍实验的目的、方法、结果和讨论，希望能对细菌的形态学研究提供一定的参考。
实验目的：1. 了解细菌的形态特征，包括形状、大小和结构等；2. 掌握细菌形态检查的基本方法和技巧；3. 分析不同形态的细菌在环境适应和病原性方面的差异。
实验方法：1. 样本收集：从不同环境中采集细菌样本，包括土壤、水体和人体等；2. 样本处理：将采集到的细菌样本进行培养和纯化，获得单一细菌种类的纯培养物；3. 镜检观察：将纯培养物取一滴放在玻璃片上，加一滴透明油滴于其上，用显微镜进行观察；4. 形态测量：通过显微镜观察，测量细菌的长度、宽度和形状等参数；5. 形态分类：根据细菌形态特征，将其分为球菌、杆菌、螺旋菌等不同形态类型。
实验结果：经过实验，我们观察到了多种不同形态的细菌。
其中，球菌呈圆形或卵圆形，直径在0.5-2微米之间；杆菌呈长条状，长度在1-10微米之间；螺旋菌呈螺旋状，长度和宽度均在2-20微米之间。
此外，我们还观察到了一些特殊形态的细菌，如分枝杆菌和链球菌等。
讨论：细菌的形态特征与其在环境适应和病原性方面密切相关。
球菌通常具有较强的耐受力和适应性，能够在不同环境中生存和繁殖。
链球菌则常常是人体感染的致病菌之一，其球状结构有助于其在宿主细胞表面附着和侵袭。
杆菌则具有较高的代谢活性和生长速度，常见于土壤和水体等环境中。
螺旋菌则多分布于水体中，其螺旋形状有助于其在水中的游动。
细菌的形态特征还与其生长环境和营养需求密切相关。
例如，分枝杆菌的分枝结构有助于其吸收营养和释放代谢产物，使其能够在养分较为匮乏的环境中生存。
此外，细菌的形态特征还可用于分类和鉴定。
通过观察细菌的形态特征，可以初步确定其属于哪一类细菌，进而进行进一步的分类和鉴定。
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查是指通过观察细菌的形态、结构和大小来进
行分类和鉴定的方法。
常用的方法包括：
1. 显微镜观察，使用光学显微镜或电子显微镜观察细菌的形态
和结构。
通过放大细菌的形态特征，如形状、大小、细胞壁结构等
来进行分类和鉴定。
2. 染色法，常用的染色方法包括革兰氏染色、折射率染色、吉
姆萨染色等，这些染色方法可以使细菌在显微镜下更清晰地显示出
形态特征，有助于鉴定。
3. 形态培养特性，利用不同的培养基和培养条件，观察细菌在
不同环境下的生长特性和形态变化，如菌落形态、生长速度等。
4. 生化反应，通过观察细菌对不同生化试剂的反应，如碘试验、氧化酶试验等，来鉴定细菌的形态学特征。
5. 分子生物学方法，包括PCR、序列分析等技术，通过对细菌
的基因组进行分析，可以更准确地鉴定细菌的形态学特征。
综上所述，细菌的形态学检查常用的方法包括显微镜观察、染色法、形态培养特性、生化反应和分子生物学方法，这些方法可以从不同角度全面地观察和鉴定细菌的形态学特征。
细菌形态学检查法(一)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------细菌形态学检查法(一)细菌形态学检查法(一) 细菌形态学检查法（一）细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。
临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。
一、显微镜细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。
细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。
1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长 0.4～0.7m，最大分辨率 0．2m，约为波长的一半。
人肉眼能分辨的最小距离是 0．2mm，因此用油镜放大 1000 倍，0．2m 的微粒即被放大到肉眼可见的 0．2mm。
一般细菌都大于 0．m，故可用普通光学显微镜进行观察。
2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。
观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效1 / 3果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。
根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。
因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。
细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。
用于观察细菌的结构及鉴别细菌。
细菌的形态检查实验报告
细菌的形态检查实验报告
《细菌的形态检查实验报告》
在生物学实验室中，细菌的形态检查是一项重要的实验，它可以帮助科学家们
更好地了解细菌的结构和特征，从而为疾病的预防和治疗提供重要的参考依据。
在这个实验中，我们对不同类型的细菌进行了形态检查，并取得了一些有趣的
发现。
首先，我们从不同的环境样本中分离出了一些细菌，并在琼脂平板上进行了培养。
经过一段时间的培养，我们观察到了不同形态的细菌，有的呈现出球状，
有的呈现出杆状，还有的呈现出螺旋状。
这些不同形态的细菌为我们提供了很
多有价值的信息。
接下来，我们对这些细菌进行了染色处理，使用了革兰氏染色和折射染色两种
方法。
通过这些染色方法，我们可以更清晰地观察到细菌的细胞壁结构和形态
特征。
我们发现，一些细菌在革兰氏染色后呈现出紫色或蓝色，而在折射染色
后呈现出粉红色或红色。
这些染色结果为我们提供了更多的信息，帮助我们进
一步了解细菌的特性。
最后，我们利用显微镜对这些细菌进行了观察。
通过放大镜头，我们可以清晰
地看到细菌的形态特征，包括细胞壁、细胞质和细胞核等。
我们发现，不同形
态的细菌在显微镜下呈现出不同的特征，这些特征有助于我们对细菌进行分类
和鉴定。
通过这次形态检查实验，我们对细菌的形态特征有了更深入的了解。
这些了解
为我们进一步研究细菌的生物学特性和病原机制提供了重要的基础，也为我们
今后的科研工作提供了宝贵的参考。
希望通过我们的努力，能够为人类健康和
医学科研做出更大的贡献。
细菌形态学检查法
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
3.其他染色方法（1）源自毛染色 （2）荚膜染色细菌形态学检查法
重点提示
• 不染色标本的形态学检查 • 染色标本的形态学检查
– 革兰染色 – 抗酸染色
一、显微镜
1.普通光学显微镜（light microscope）
– 光源：可见光
2. 暗视野显微镜（ dark field microscope ）
– 暗背景，菌体发光 –用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运
1.革兰染色（Gram staining） （1）原理
– 细胞壁学说：两种细菌细胞壁结构不同-G+菌肽 聚糖层厚、致密，脂质含量少；G-菌薄而疏松， 脂质含量多。
– 等电点学说： G+菌pI 2～3； G-菌pI 4～5 – 化学学说： G+菌含有核糖核酸镁盐多， G-菌
含量少。
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
（2）结果
– 细菌分为革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌
紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌
革 兰 染 色 方 法
三、细菌染色标本的检查
2.抗酸染色
（1）原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要 成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石 炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用， 因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到初步鉴别细 菌的目的。
复红、刚果红等。
3.中性染料：碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞
氏染料、姬姆萨染料等。
三、细菌染色标本的检查
(二)常用染色方法 • 单染色法
– 只用一种染料，如吕氏美蓝。用于观察细菌的 形态、大小、排列。
细菌的形态学检查
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革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
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细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
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二、细菌标本染色检查法
技能点13病料中细菌的形态学检查.
国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库《动物微生物与免疫技术》技能点13 病料中细菌的形态学检查
实训目标
1．病料中细菌的形态学检查实验目标：
通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料是否取自细菌感染病例。
若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类
2．病料中细菌的分离培养实验目标：
用鉴别培养基分离培养后，看是否得到菌落。
若有菌落生长，则根据菌落特征进一步鉴定细菌种类。
仪器及材料疑似大肠杆菌病料、镊子、剪刀、玻片、酒精灯、染色缸及染色架、美兰染液、吸水纸、擦镜纸、香柏油、乙醇乙醚、洗瓶、烙刀、接种环、麦康凯平板、记号笔、温箱、酒精灯等
方法与步骤
1．触片以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做数个压印或涂抹成适当大小的一薄层。
2．干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处微烤加热干燥。
3．固定火焰固定是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4～6次），以手背触及玻片微烫手为宜。
4．美蓝染色在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干和镜检，结果菌体呈蓝色。
细菌的形态检查主要有哪几种方法 _
细菌的形态检查主要有哪几种方法 ?说起细菌，大家都不陌生，随着科技的高速发展，细菌逐渐走进了人们的生活，无论是男女老少，对于细菌都或多或少知道一些常识。
例如面团需要发酵，则需要酵母；酸奶需要乳酸菌才能变得可口；酒在醋酸菌的作用下才能成为调味品——醋；而腹泻是因为大肠杆菌作祟等等。
更有文章指出人类身体表面细菌覆盖率高达90%！可见，细菌与人们的生活关系十分密切，那么细菌究竟是何方神圣呢？细菌最早是被科学家列文虎克在一位从未刷过牙的老人牙垢上所发现的，只不过那时人们认为细菌是自然界已有的生物。
直到后来，在巴斯德实验之后，人们才知道，细菌是由空气中已有细菌产生的，而不是自行产生，人们才慢慢终于揭开了这位神秘人物的面纱。
1 细菌的构造及其繁殖细菌的结构包括基本结构和特殊结构。
细菌都具有的普遍结构即基本结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质以及核质。
而某些细菌特有的结构称为特殊结构，包括细菌的荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
每一种结构都各司其职，有其独特的作用，例如鞭毛是某些细菌的“双腿”。
可以让细菌来去自如；荚膜可以保护细菌不被白细胞吞噬，抵御外部的不利环境等。
按照不同的分类依据，细菌可以被分成许多类型。
按细菌的生活方式来分类，细菌可以分成自养菌和异养菌，其中异养菌包括腐生菌和寄生菌；根据形状可以分为球菌、杆菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺杆菌）；按细菌生存温度分类，可分为喜冷、常温和喜高温三类。
另外，细菌的繁殖速度极快，这是由它们独特的繁殖方式所决定的，即无性二分裂(裂殖)：细菌生长到一定时期，在细胞中间逐渐形成横隔，由一个母细胞分裂为两个大小相等的子细胞。
一般细菌约20到30分钟便分裂一次，即为一代。
不难想象，若是环境适宜，且时间充分的条件下，细菌的繁殖会有多么迅速！用不了多久，世界都是细菌的“殖民地”了。
2 细菌的形态检查方法什么是细菌形态检查？细菌形态检查就是对细菌的菌体形态和菌群的形态进行观察，进而对所检查的细菌的类型进行归属和划分菌属的检查方法。
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定是通过对细菌在特定生理和生化条件下的反应进行观察和分析，以确定其种类和特性的过程。
这通常包括一系列实验，涉及对细菌代谢途径、酶活性、生长条件等方面的研究。
以下是细菌生理生化鉴定的一些常见方法和实验：
1.形态学观察：
形状：观察细菌的形状，可以是球形（球菌）、杆状（杆菌）、螺旋形等。
结构：使用显微镜检查是否有胞壁、胞膜、纤毛、鞭毛等结构。
2.生理特性：
生长条件：观察细菌在不同温度、pH值和氧气条件下的生长情况。
营养需求：测试细菌对不同营养物质（碳源、氮源、矿物质等）的利用能力。
3.生化反应：
大肠杆菌的IMViC测试：Indole（吲哚）测试、Methyl Red（甲基红）测试、V oges-Proskauer（V-P）测试、Citrate（柠檬酸）测试、
4．氧化还原反应：观察细菌对不同氧化还原指示剂（如甲基红、溴亚甲蓝）的反应，推断其对氧化还原条件的适应性。
5.酶活性测试：
氧化酶：使用氧敏感指示剂观察酶的活性。
淀粉酶：利用淀粉琼脂板，观察菌落周围是否发生淀粉分解带。
蛋白酶：使用明胶板检测细菌对蛋白质的分解能力。
6.抗生素敏感性测试：确定细菌对不同抗生素的敏感性，通过纸片扩散法或肉汤稀释法进行。
7.分子生物学方法：16S rRNA测序：通过测序菌株的16S rRNA基因，进行分子水平的种类鉴定。
8.培养基选择：利用特定培养基，如MacConkey琼脂培养大肠杆菌等，根据细菌在培养基上的生长情况进行初步鉴定。
细菌标本形态学检验
细菌标本形态学检验形态学检查方法是细菌检验中极为重要的鉴定手段之一，它不仅有助于细菌的初步识别，同时也是决定进行生化反应鉴定的重要步骤。
如痰中的抗酸杆菌、脑脊液中脑膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。
通过形态学检查得到初步的诊断。
由于细菌体积小，无色透明，因此利用光学显微镜直接检查只能观察到细菌的动力，对形态、大小、排列方式、染色特性及特殊结构的判定，还须借助于染色标本的观察。
要研究其细菌的超微结构，还需用电子显微镜。
一、不染色标本检查法不染色标本的检查用于观察活菌状态，常用以检查细菌的动力或运动状况。
1．湿片法：用接种环取细菌培养液两环，置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。
菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。
高倍镜下观察。
2．悬滴法：加一小滴菌液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上，迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。
高倍镜下观察。
3．毛细管法：本法适用于观察厌氧菌动力。
先将待检菌接种在适宜的液体培养基中，经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60～70nm ，管径0．5 ～1．0nm ）接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。
二、染色标本检查法（一）基本方法细菌胞浆无色透明，不易识别。
常用适宜的染料使细菌着色后，以观察其形态和特殊构造，且可按染色反应进行分类。
1．原理（1）物理吸附作用：由于毛细管现象和渗透作用，使染料进入细胞内被溶解吸收。
此外，细菌等电点较低，pH值2 ～5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。
（2）化学反应：菌体内某些化合物和染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所脱色。
（3）其他因素：细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电解质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。
2．方法（1）涂片：临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。
细菌形态与结构的检查法[技巧]
![细菌形态与结构的检查法[技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/fa965d68a36925c52cc58bd63186bceb19e8ed6e.png)
细菌形态与结构的检查法细菌形态与结构的检查法[适用对象] 中医学（骨伤方向）、针灸推拿学专业[实验学时] 3学时一、实验目的1、学会显微镜油镜的使用和保护方法。
2、认识细菌的基本形态和特殊结构(荚膜、鞭毛、芽胞)。
3、掌握革兰氏染色方法。
4、了解细菌的动力。
二、实验原理1、显微镜油镜的使用原理: 观察细菌必须用放大1 000倍左右的油镜。
油镜的透镜极小，工作焦距最短,光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射人镜筒的光线极少，视野暗、物象不清晰。
如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物像。
2、革兰染色法的原理：主要是革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁有差异，另外革兰阳性菌的等电点比革兰阴性菌低，与碱性染料的亲和力强。
三、仪器设备1、显微镜2、细菌标本片：(1)葡萄球菌(革兰染色)(2)大肠杆菌(革兰染色(3)霍乱弧菌(革兰染色)(4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色(6)破伤风杆菌(芽胞染色)萄球菌、绿脓杆菌的琼脂斜面18～24小时培养物。
4、染色液有结晶紫、碘液、95％酒精、稀释石炭酸复红。
四、相关知识点细菌是一类体积微小的单细胞原核细胞型微生物，活的菌体小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用普通光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易是别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。
因此，为了研究细菌的形态特征和鉴别不同类群的细菌，细菌的染色及形态构的观察是位生物学实验中十分重要的基本技术。
五、实验步骤显微镜油镜的使用显微镜使用方法①将显微镜平稳的安放在试验台适宜处②用低倍镜对光，调节反光镜，天然光源用平面反光镜，人工光源或光线较弱使用凹面反光镜。
检查染色标本要用强光，应将聚光器升到最高，光圈完全开大；若检查未染色的活体标本则用弱光，聚光器适当下降，光圈适当缩小。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
微生物学理论指导：细菌形态和结构的检查法
一、显微镜
细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜放大后才能看到。
显微镜包括普通光学显微镜、电子显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和共聚焦显微镜等，适用于观察不同情况下的细菌形态或结构。
二、染色法
细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。
染色法有多种，最常用的分类鉴别染色法是革兰染色法。
革兰染色法：
1.方法是固定的细菌标本先用碱性染料结晶紫初染，再加碘液媒染，使之生成结晶紫-碘复合物；此时不同细菌均被染成深紫色。
然后用95%乙醇处理，最后用稀释复红或沙黄复染。
2.结果判断可将细菌分为两大类：不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌，被乙醇脱色后复染成红色者为革兰阴性菌。
3.医学意义：①鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。
②选择药物参考：G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性。
③与致病性有关：大多G+菌的致病物质是外毒素，而G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。
临床微生物学检验技术
二、染色标本
· 细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、 排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因 此染色标本的检查在细菌的初步鉴定中应用最广，起 着非常重要的作用。
· （一）常用染料：酸性染料、碱性染料、复合染料。 · （二）常用的染色方法：革兰染色、抗酸染色、
荧光染色。
革兰染色
三、生化反应
（一）碳水化合物的代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶， 因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分 解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌 对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力， 可用以鉴定细菌种类。
方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中， 35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示 剂，立即观察结果。
结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔 红色为弱阳性。
应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠 埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠 杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌 属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
3
革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结
晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革
兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形
成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
2. 染色方法
1 标本涂片、干燥和固定。 2 染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴， 室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴 加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴， 轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片， 使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的 酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。 3 标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后 用油镜观察。
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显微镜是人类各个时期最伟大的发明物之一。在它发明出来之前，人类关于周围世界的 观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。 显微镜把一个全新的世界展现在人类的视野里。人们第一次看到了数以百计的“新的” 微小动物和植物，以及从人体到植物纤维等各种东西的内部构造。显微镜还有助于科学家发 现新物种，有助于医生治疗疾病。上图：这是17世纪英国科学家罗伯特· 胡克的显微镜。它有 一根内装透镜的简易皮管，安放在一个可调整的架子上。灌满水的玻璃球用来把光聚焦到物 体上。 最早的显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来的。发明者可能是一个叫做札恰里亚斯· 詹森 的荷兰眼镜商，或者另一位荷兰科学家汉斯· 利珀希，他们用两片透镜制作了简易的显微镜， 但并没有用这些仪器做过任何重要的观察。 后来有两个人开始在科学上使用显微镜。第一个是意大利科学家伽利略。他通过显微镜 观察到一种昆虫后，第一次对它的复眼进行了描述。第二个是荷兰亚麻织品商人安东尼· 凡· 列 文虎克（1632年-1723年），他自己学会了磨制透镜。他第一次描述了许多肉眼所看不见的微 小植物和动物。 1931年，恩斯特· 鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家 能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986年他被授予诺贝尔奖。
5.视场直径 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范 围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场 内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于 观察。 6.覆盖差 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由 于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射 后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。 覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。 国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围 在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差 计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的 盖玻片的厚度。 7.工作距离 WD
二、成象原理
物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦 距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然 形成一个倒立的放大的实像。 放大的实像位于目镜的物方焦点上，或者在很靠近 F2的位置上。再经目镜放大为虚像后供眼睛观察。虚像 的位置取决于物方焦点和放大实像之间的距离，可以在 无限远处，也可以在观察者的明视距离处。目镜的作用 与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不 是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的 像。
一、基本光学原理
1.折射
2.透镜的性能 3.凸透镜的五种成象规律
折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传 播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现 象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当 与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体 ( 如玻璃 ) 时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。
第一节 光学显微镜的发展历史
早在公元前一世纪，人们就已发现球形透明物体 可使物体放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物 体放大成像的规律有了认识。 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类 似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略 和德国的开普勒通过实验研究出合理的显微镜光路结 构。
显微镜的构造概说
• • • • • • 目镜 镜筒 旋转盘 高倍物镜 低倍物镜 镜臂 • 固定夹 • 载物台 • 粗调节 轮 • 细调节 轮 • 反光镜( 灯光) • 光圈
目镜
•放大倍率有10X / 15X ，可因应个人的双眼 距离来调整
镜筒
• 介于接目镜与接物镜 之间
旋转盘
•接于镜筒下方，通常 有三个接孔，可接不 同倍数的接物镜，本 身可以旋转藉以更换 不同倍数的接物镜。
镜座
•显微镜之最底部。
不同显微镜物镜的特性比较 [光(450nm时可以达到的分辨率)]
物镜特性 搜索物镜 低倍镜 高倍镜 油镜
放大倍数 4× 10× 40~45× 90 ×
数值孔径值 0.10 0.25 0.55~0.65
焦深 40mm 16mm 4mm
工作距离 17~20mm 4~8mm
蓝光 2.3 m 0.9μm
Numerical Aperature
Resolution
Rayleigh Criterion
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透镜的性能 透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜 目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的 不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。 当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这 个点称"焦点"，通过交点并垂直光轴的平面，称"焦平面"。 焦点有两个，在物方空间的焦点，称"物方焦点"，该处的焦 平面，称"物方焦平面"；反之，在象方空间的焦点，称"象方 焦点"，该处的焦平面，称"象方焦平面"。 光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成倒立实 像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。
古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组 合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜 中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接 收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合 器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完 整的图像信息采集和处理系统。
第二节 显微镜原理
1665年前后，英国的胡克在显微镜中加入粗动和 微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。 1673～1677年期间，荷兰的列文胡克制成单组元放大 镜式的高倍显微镜。 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微 镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一 个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定 了显微镜成像的古典理论基础。
第三节 照明方法
显微镜的照明方法按其照明光束的形成，可分 为“透射式照明”，和“落射式照明”两大类。前者 适用于透明或半透明的被检物体，绝大数生物显微镜 属于此类照明法；后者则适用于非透明的被检物体， 光源来自上方，又称“反射式照明”。主要应用与金 相显微镜或荧光镜检法。
一、透射式照明
1.临界照明 光源经过聚光镜后，成像于物平面上,若忽略光能的 损失，则光源像的亮度与光源本身相同，因此，这种方 法相当于在物平面上放置光源。 2.柯拉照明 临界照明中物面光照度不均匀的缺点，在柯拉照明 中可以消除。在光源与聚光镜之间加一辅助聚光镜。可 见，由于不是直接利用光源，而是把光源均匀照明了的 辅助聚光镜（也称为柯拉镜）成像在标本上，所以物镜 的视场（标本）得到均匀的照明。
Definitions
• Acceptance angle θ • Numerical Aperture NA = n sinθ • Rayleigh resolution criterion for a circular aperture Δx = 0.61 λ/NA
θ
Rayleigh criterion for resolution
高倍物镜-低倍物镜
•有不同倍数在标本上 方 • 低倍镜放大倍数小， 较短，视野亮。 • 高倍镜放大倍数大， 较长，视野暗。
镜臂
• 连接镜筒及镜座，可 供握取显微镜。
固定夹
• 夹住标本避免滑落
载物台
• 为放置标本玻片的平 台，中央有一圆孔， 可供光线通过。
粗调节轮
• 位于镜臂两侧，可调 节载物台的升降，以 供对焦 • 转动时镜筒升降的幅 度大。
细调节轮
• 位于镜臂两侧，可调 节载物台的升降，以 供对焦 • 转动时镜筒升降的幅 度小。 • 使用高倍物镜时的专 用调节轮
反光镜
• 位于载物台下方中央 ，由凹面镜子组成， 可使光线向上反射， 经过载物台上的圆孔 进入物镜和目镜，到 达观察者的眼睛。 • 但若阳光不强则需用 灯光加强光源
光圈
• 接于反光镜上方，上 有一支调整柄，可用 以调整光圈孔径大小 ，以调整投射于标本 上之光线强弱 。
二、落射式照明
在观察不透明物体时，例如通过金相显微镜观察 金属磨片，往往是采用从侧面或者从上面加以照明的 方式。此时，被观察物体的表面上没有盖玻璃片，标 本像的产生是靠进入物镜的反射或散射光线。
三、暗视场照明方法
用暗视场方法可以观察超显微质点。所谓超显微质 点，是指那些小于显微镜分辨极限的微小质点。暗视场 照明的原理是：不使主要的照明光线进入物镜，能够进 入物镜成像的只是由微粒所散射的光线。因此，在暗的 背景上给出了亮的微粒的像，视场背景虽暗，但衬度（ 对比）很好，可以使分辨率提高。 暗视场照明又有单向和双向之分。
三、光学技术参数
1.数值孔径 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物 体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘 积。用公式表示如下：NA=n · sinα 2.分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分 的两个物点的最小间距，又称“鉴别率”。其计算公式是 σ =λ /2 ·NA 3.总放大倍率＝单个物镜的放大倍率×目镜的放大倍 率 4.焦深 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时 ，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都 可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得 清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。
显微镜 的使用
显微镜的发明，使人看到了许多以前从未看到 过的生物，如细菌、病毒等，也使人看到了生物的 许多微小结构，如线粒体的结构，从而对生物学的 发展起着重要的推动作用。显微镜是生物学研究的 重要仪器之一。在医学、工农业生产中显微镜也有 着重要用途，例如在医学诊断上，可对人血液中的 红细胞进行计数等。
OPTICAL MICROSCOPES
Image construction for a simple biconvex lens
凸透镜的五种成象规律 1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方 二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二 倍焦距上形成同样大小的倒立实象； 3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时， 则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； 4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象； 5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象 的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大 的直立虚象。