巯基化壳聚糖衍生物自组装纳米球的制备与表征

文章编号:1001-9731(2014)06-06140-04

巯基化壳聚糖衍生物自组装纳米球的制备与表征∗

刘英杰1,段瑞平1,刘玲蓉1,杜㊀博1,王静洁1,熊青青1,张其清1,2

(1.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所,天津市生物医学材料重点实验室,天津300192;

2.福州大学生物和医药技术研究院,福州350002)

摘㊀要:㊀以N-羟基琥珀酰亚胺(N H S)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C㊃H C l)为催化剂,将制备的双羧基聚乙二醇(C O O H-P E G-C O O H)和部分巯基化聚乙烯亚胺(P E I-S H x)先后接枝于壳聚糖分子,得到巯基化壳聚糖衍生物(C S-P E G-P E I)㊂利用傅立叶红外光谱仪(F T-I R)和核磁共振仪(1H NM R)对其结构进行表征;通过透析法制备自聚集纳米粒,透射电子显微镜(T E M)和动态激光粒度分析仪(D L L S)分析测试自聚集纳米粒显示,自聚集纳米粒为球状纳米胶束,该纳米球有望成为纳米药物及基因的载体㊂

关键词:㊀壳聚糖;聚乙二醇;巯基化聚乙烯亚胺;自组装

中图分类号:㊀O629文献标识码:A D O I:10.3969/j.i s s n.1001-9731.2014.06.030

1㊀引㊀言

巯基化合物是一类重要的医药中间体而受到人们的广泛研究,主要集中应用于纳米药物载体[1]㊁生物凝胶材料制备[2]㊁基因载体[3]以及与纳米金结合[4]等方面㊂巯基化壳聚糖因其良好的生物特性得到广大研究者的青睐㊂壳聚糖(C h i t o s a n,C S)又叫脱乙酰甲壳素,是自然界存在的唯一碱性多糖,具有良好的生物相容性㊁低毒性㊁可降解性及粘附性,被广泛应用于化工㊁食品㊁化妆品㊁生物医药等方面㊂但是壳聚糖在水中的溶解性小,限制了其在生物医药材料方面的应用,通过与壳聚糖分子中的活性基团反应引入改性基团如胆甾醇[5]㊁聚乙二醇[6]㊁巯基等可以改变其物理化学性能,有利于其在生物医学材料领域的应用㊂聚乙二醇(P E G)是一种应用广泛的水溶性聚醚,它可用于医药㊁卫生㊁食品㊁化工等行业㊂本课题组已报道了聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖自组装纳米球用于甲氨蝶呤缓释释放的研究[6],该研究表明壳聚糖经聚乙二醇改性后,壳聚糖水溶性增加并能够自组装成胶束㊂

低分子量聚乙烯亚胺(P E I)具有较低的生物毒性,其大分子链上拥有大量可与多种活性基团反应的氨

基㊂因此,本文将低分子量聚乙烯亚胺与巯基乙酸甲酯反应得到部分巯基化的聚乙烯亚胺,并用羧基化聚乙二醇和部分巯基化聚乙烯亚胺接枝到壳聚糖上,得到巯基化壳聚糖衍生物,利用其在水溶液中自组装的性质制备成纳米球㊂由于巯基化壳聚糖衍生物中含有丰富的羧基和氨基,可进一步与其他活性基团或药物反应,可作为一种新型的药物载体在药物制剂研究中得到应用㊂

2㊀实㊀验

2.1㊀主要原料与仪器

壳聚糖(C S,M w=200k D a,脱乙酰度为90.1%,浙江澳兴生物技术有限公司),采用先酸化溶解,再碱化沉淀的方法纯化;聚乙烯亚胺(P E I,M w=800D a, M n=600D a,S i g m a);5,5 二硫代双(2-硝基苯甲酸) (D T N B,S i g m a);4-二甲氨基吡啶(D MA P,F l u k a);N-羟基琥珀酰亚胺(N H S,F l u k a);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C㊃H C l,上海延长生化科技发展有限公司);巯基乙酸甲酯(F l u k a);聚乙二醇(P E G,M n=2000D a,上海生工生物工程有限公司);丁二酸酐(天津市福晨化学试剂厂),其它试剂均为市售分析纯,实验用水均为纯水㊂

探头超声仪(UH-500A,A u t o m a t i cS c i e n c eI n-s t r u m e n tC O.,L T D);透射电子显微镜(T E M,J E M-100C XⅡ,J a p a n);紫外-可见分光光度计(U V-V i s, L a m b d a35,P e r k i n e l m e r);冷冻干燥机(G O L D-S I M, S I M);透析袋(MW C O8000-14000,U S A);核磁共振仪(NM R,V a r i a n I n o v a500,U S A);傅立叶变换红外光谱仪(F T-I R,N i c o l e tN e x u s470-E S P,U S A);动态激光粒度分析仪(D L L S,M a l v e r nN a n o-Z S,U K)㊂2.2㊀聚乙二醇基壳聚糖(C S-P E G)的合成

按文献[7-8]方法制备双羧基聚乙二醇,再以双羧基聚乙二醇与壳聚糖为原料通过NH S/E D C催化反应[9-10]合成聚乙二醇基壳聚糖㊂称取0.2g(0.91m m o l N H2)纯化壳聚糖溶于磷酸盐缓冲液(0.1m o l/L, P B S,p H值=6.0)中,搅拌溶解过夜,充分溶解后向溶

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02014年第6期(45)卷

∗基金项目:国家自然科学基金资助项目(31271023,91323104);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(院所1304)

收到初稿日期:2013-09-18收到修改稿日期:2013-11-10通讯作者:张其清,E-m a i l:z h a n g q i q@126.c o m

作者简介:刘英杰㊀(1989-),女,河南禹州人,在读硕士,师承张其清教授,主要从事纳米药物缓控释制剂方面研究㊂

液中加入500.5m g 双羧基聚乙二醇(

0.455mm o l C O O H ),继续搅拌至溶解,加入N H S (89m g ,0.77mm o l ),继续搅拌15m i n 加入E D C ㊃H C l

(147m g

,0.77mm o l ),室温搅拌24h ㊂过滤反应液,将其移入透析袋(MW C O8000-14000)

,蒸馏水透析,冷冻干燥,即得到化合物C S -P E G 衍生物㊂通过改变投料比得到不同P E G 取代度的聚乙二醇基壳聚糖,并采用红外光谱仪(K B r 压片)和1H NM R (D 2O )对产物进行结构表征㊂

2.3㊀壳聚糖-P E G -P E I 的合成

选择低分子量(M w 800)的聚乙烯亚胺(P E I

)与巯基乙酸甲酯反应得到部分巯基化的聚乙烯亚胺[11

],再通过N H S /E D C 催化反应[9-10

],使化合物C S -P E G 与

部分巯基化聚乙烯亚胺反应得到壳聚糖-P E G -P E I 衍

生物(C S -P E G -P E I )㊂称取0.2g C S -P E G (D S P E G

50%,0.08mm o l C O O H )衍生物溶于10m L 磷酸

盐缓冲液(0.1m o l /L ,P B S ,p H 值=6.0)中,并加入部分巯基化聚乙烯亚胺66.8m g P E I -S H x (

x =3.1,M n =835.3D a ,0.08mm o l )充分搅拌溶解后加入N H S

(15.61m g

,0.136mm o l ),继续搅拌15m i n 后加入E D C ㊃H C l (26.07m g

,0.136mm o l ),室温搅拌24h ㊂过滤反应液,将其移入透析袋,蒸馏水透析,冷冻干燥,即得到化合物C S -P E G -P E I 衍生物㊂通过改变投料比得到不同P E I 取代度的衍生物,

并采用红外光谱仪(K B r 压片)和1H NM R (D 2O )对产物进行结构表征㊂2.4㊀自组装纳米球的制备称取一定量的改性材料加入2%乙酸溶液中,探

头超声2m i n

,然后转入透析袋中蒸馏水透析处理9h ,

前3h 隔1h 换一次水,之后每隔2h 换一次水㊂透析完毕,用0.45μm 微孔滤膜过滤㊂将样品溶液滴于铜网上,自然晾干,透射电子显微镜观察样品形貌;采用动态光散射法对样品的自聚集纳米球的粒径㊁粒径分布进行检测㊂

3㊀结果与讨论

3.1㊀合成方法与结构表征

双羧基聚乙二醇的羧基与糖环的氨基发生反应,得到聚乙二醇化壳聚糖衍生物,然后再与部分巯基化聚乙烯亚胺反应,得到一系列不同取代度的壳聚糖衍生物,具体合成路线如图1所示㊂

图1㊀壳聚糖衍生物合成路线

F i g 1S y

n t h e t i c r o u t e o f c h i t o s a nd e r i v a t i v e s ㊀㊀壳聚糖衍生物的化学结构用1H 核磁共振光谱测定㊂由图2可知,其中原料壳聚糖各吸收峰归属如下

δ(ˑ10-6):δ3.1(糖环H 2);δ3.5~3.9(

糖环H 3㊁H 4㊁H 5和H 6)㊂C S -P E G 的1H NM R 谱图中出现了P E G -C O O H 的特征峰,分别为:δ2.46,2.59ˑ10-6

处和δ4.26ˑ10-6处的吸收峰,且这两处吸收峰的积分比为2ʒ1,由此证明合成产物为C S -P E G ㊂巯基氢属于活泼氢易被溶剂氘代水氘代,巯基峰较难分辨;但C S -P E G -P E I 谱图中δ(2.7~3.0)ˑ10-6出现了新的吸收峰,为P E I 分子中亚甲基氢的吸收峰,

即合成化合物C S -P E G -P E I ㊂本文采用核磁共振光谱法估算C S -P E G 中P E G 的取代度,根据参考文献[12-13

],由公式D S P E G =S (δ4.26ˑ10-6)/4S (δ3.1ˑ10-6)计算结果证明,合成的壳聚糖衍生物P E G 取代度分别为24%,

31%和50%㊂

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4160刘英杰等:巯基化壳聚糖衍生物自组装纳米球的制备与表征