测定叶绿素a和b的方法及其计算
叶绿素测定方法
实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法)根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。
在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm 下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb (2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3)Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定一、实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素中测定叶绿素a、叶绿素b的方法。
二、实验原理；根据叶绿体色素提取液对可见光的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测其吸光度，即可利用公式计算出提取液中各种色素的含量：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649-7.32 A665C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665三、仪器、试剂与材料：仪器：分光光度计、离心机、研钵；试剂：96%乙醇溶液、石英砂、CaCO3粉末；材料：菠菜叶片；四、实验步骤：1.取干净的菠菜叶片剪碎，分别混匀。
2.称取剪碎的样品0.2g，各2份，分别放入研钵中，加少量石英砂和CaCO3粉末、及2-3ml 96%乙醇溶液，研成匀浆，倒入离心管，再用96%乙醇溶液多次洗涤研钵，洗涤液也倒入离心管中。
3．将离心管放入离心机后取上述提取液放入比色皿中，以96%乙醇为对照，分别测定665nm、649nm处的吸光度值。
4.按公式计算提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。
五、实验结果及分析：1.研磨提取叶绿素是加入石英砂和CaCO3粉末各有什么作用？加入石英砂有助于研磨得更充分；加入CaCO3粉末可以保护叶绿素在研磨时不被破坏。
2.计算: A665(1)=0.399A A665(2)=1.237A 故A665=0.818AA649(1)=0.208A A649(2)=0.626A 故A649=0.417A 所以: Ca=13.95A665-6.88A649=8.542Cb=24.96A649-7.32 A665=4.421C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665=12.963。
实验5 叶绿素a与叶绿素b含量的测定
C—叶绿素的浓度（mg/L)；v—提取液体积(ml)； n—稀释倍数；m—样品鲜重（g)
作业：
比较阳生植物和阴生植物的叶绿素有何不 同？
下周实验：植株磷素的测定(钼蓝法)
三、实验器料
1、材料： 菠菜或其它绿色植物叶片
2、试剂： 80% 丙 酮 或 96% 乙 醇 ； 石 英 砂 ；
CaCO3； 3、仪器：分光光度计（分光光度计
的使用）、高速离心机
四的植物叶片，称取0.2g剪碎后置 于研钵中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和 石英 砂。充分研磨（组织变白），再加10ml80%丙 酮，静止3-5分钟，冲洗研钵后转至离心管，定 容至15ml,3000转、15分钟，取上清液用80% 丙酮 定容至25ml。
2. 测定OD值： 取上清液1ml，加80%丙酮4ml， 以80%丙 酮
作空白对照，用分光光度计分别测定叶绿 素提取液在645nm、663nm、470 nm下的吸
光度。 3.计算：
把测出的吸光值带入(1)(2)(3)(4)式计算叶 绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度。 根据下式求出植物组织中叶绿素的含量：
实验六 叶绿素含量的测定
一、实验目的
1、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶 液中测定叶绿素a、b和类胡萝卜素 的方法及计算；
2、测定叶绿素含量a与叶绿素b含量 的意义。
二、实验原理
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a、叶绿素b和 类胡萝卜素，三者的吸收光谱虽有不同，但又 存在着明显的重叠，在不分离他们的情况下同 时测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度， 可分别测定在663nm、645nm、470 nm （分别是叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素在红 光区的吸收峰）的光吸收，然后根据 Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素 a、叶绿素b、和类胡萝卜素的浓度。
叶绿素含量测定方法
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
叶绿素含量实验报告
一、实验目的1. 了解叶绿素的提取和分离方法。
2. 掌握分光光度法测定叶绿素含量的原理和步骤。
3. 分析不同植物叶片中叶绿素含量的差异。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，主要由叶绿素a和叶绿素b组成。
叶绿素在特定波长下具有特征吸收峰，利用分光光度法可以测定叶绿素的含量。
本实验采用95%乙醇提取植物叶片中的叶绿素，通过测定叶绿素a和叶绿素b在最大吸收波长下的吸光度，计算出叶绿素含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜、新鲜青菜、新鲜甘蓝叶片。
2. 仪器：分光光度计、研钵、剪刀、移液管、比色皿、电子天平、75%乙醇、碳酸钙、蒸馏水。
四、实验步骤1. 称取新鲜菠菜、青菜、甘蓝叶片各0.5g，分别放入研钵中。
2. 加入少量碳酸钙，用研钵研磨至叶片组织变白。
3. 将研磨好的叶片转移至75%乙醇溶液中，用移液管加入5mL乙醇，充分混合。
4. 将混合液转移至比色皿中，用蒸馏水定容至10mL。
5. 以75%乙醇为空白，分别在波长663nm和645nm处测定吸光度。
6. 根据吸光度计算叶绿素a和叶绿素b的含量。
7. 分别计算三种植物叶片中叶绿素的总含量。
五、实验结果与分析1. 叶绿素a和叶绿素b的含量计算：叶绿素a含量（mg/g）= A645nm × 1000 × 0.5 / 12.0叶绿素b含量（mg/g）= A663nm × 1000 × 0.5 / 27.02. 叶绿素总含量计算：叶绿素总含量（mg/g）= 叶绿素a含量 + 叶绿素b含量3. 实验结果：菠菜叶片叶绿素总含量为：3.25mg/g青菜叶片叶绿素总含量为：2.10mg/g甘蓝叶片叶绿素总含量为：2.85mg/g4. 结果分析：通过实验结果可以看出，菠菜叶片中叶绿素含量最高，其次是甘蓝叶片，青菜叶片叶绿素含量最低。
这可能是由于不同植物叶片中叶绿素含量存在差异，与植物种类、生长环境等因素有关。
实验六叶绿素A、B 含量的测定
精品实验《水生植物抗逆生理的研究》——1
一，实验目的与要求
• 掌握叶绿素a、b含量测定的方法； • 了解逆境条件（重金属Cd污染）下植物体叶绿素含
量的变化。
二、实验材料与试剂
• 材料 不同浓度Cd2+处理7d的菹草。
• 试剂 1/10Hogland营养液； CdCl2溶液：0、5、10、20mg/L（以Cd的浓度计）； 80%丙酮。
叶绿素b（mg/gFW)=?
叶绿素a/叶绿素b=?
四、统计并分析
• 统计CdCl2处理浓度与叶绿素含量之间的关系； • 结合其他生理指标分析Cd2+对植物体生长的影响。
许石英砂和碳酸钙，研磨匀浆后过滤，再用5mL80%丙酮冲洗滤 渣，定容到10mL，混匀； • 测定：充分过滤后，以80%丙酮调零，测定叶绿素提取液在645 nm和663nm处的光吸收值。 • 计算： 叶绿素a：C=12.21A663-2.81A645
叶绿素a（mg/gFW)=? 叶绿素b：C=20.13A645-5.03A663
三、实验原理
• 叶绿素a、b的吸收光谱
• 叶绿素a、b的光吸收总和在645nm和663nm处各有一 峰值。
• A=nCL n=摩尔消光系数； C=溶液浓度； L=比色杯内径。
三、实Байду номын сангаас步骤
• 取培材养7：d适后量，菹从草顶，端在起含取有倒不数同第浓三度对C叶d片Cl2；的1/10Hogland营养液中 • 提取：叶片洗净、吸干、称重后于研钵中加入5mL80%丙酮、少
叶绿素a与叶绿素b含量的测定
实验仪器及材料
• 实验材料：
– 菠菜或其它绿色植物
• 实验仪器及试剂：
– UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器； 研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸； 丙酮；石英砂；CaCO3；
实验步骤
1. 提取叶绿素
选取有代表性的菠菜叶片数张，于天平上称取0.5g， （也可用打孔器打取一定数量的叶圆片，计算总 的叶面积），剪碎后置于研体中，加入5ml 80%丙 酮，少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀浆，用 滤斗过滤到10ml量筒中，注意在研钵中加入少量 80%丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量 筒内，并定容至10ml。将量筒内的提取液混匀， 用移液管小心抽取5ml转入25ml量筒中，再加入 80%丙酮定容至25ml（最终植物材料与提取液的 比例为W：V＝0.5：50＝1：100，叶色深的植物 材料比例要稀释到1：200）。
讨论：
1． 叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区 的吸收峰，为何不用兰光区的光吸收来 测定叶绿素的含量。 2． 计算叶绿素a与叶绿素b含量的比值， 可以得到什么结论？ 3． 比较阳生植物和阴生植物的叶绿素a和 叶绿素b的含量以及比例，可以得到什么 结论？
实验原理
• 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b， 二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的 重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同 时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定 在 663nm 和 645nm（分别是叶绿素 a 和叶绿素 b 在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据 Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和 叶绿素b的浓度。 • A663=82.04Ca+9.27Cb （1 ） • A645=16.75Ca+45.60Cb （2）
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。
一、目的掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。
二、原理叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：A663 = 82.04 C a + 9.27C b (1)A645 = 16.75 C a + 45.6C b (2)（1）、（2）式中的A663、A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。
C a、、C b为叶绿素a 、b的浓度，单位为mg·L－1。
82.04 、9.27为叶绿素a 、b在波长663nm下的比吸收系数。
16.75 、45.6为叶绿素a 、b在波长645nm下的比吸收系数。
解（1）、(2 )式联立方程，得：C a=12.70 A663– 2.69 A645 (3)C b=22.9 A645– 4.68 A663 (4)C T =C a + C b= 20.21 A645 + 8.02A663 (5)C a、C b为叶绿素a 、b的浓度, C T为总叶绿素浓度，单位：（mg ·L－1），.利用上面( 3 )、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a 、b及总叶绿素浓度。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。
3. 试剂：80﹪乙醇。
四、实验步骤1. 叶绿素的提取从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g (可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙醇10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量的测定(分光光度法)
实验步骤
4. 称重比较：将叶片对应部位重叠在一起，用 打孔器均匀打相同数目的孔（50），分别置 于光照及黑暗的两个称量皿中，80-90℃下 烘干至恒重，在分析天平上称重比较。
少许碳酸钙和石英砂，仔细研磨成匀浆，用蒸馏水定容到 10 mL。然后用移液管吸取2.5 mL，置于一大试管中，加 入丙酮7.5 mL，摇动试管，促使叶绿素溶于丙酮中，静置 片刻使残渣沉于管底，将上面绿色上清夜过滤在另一干净 的试管中，此即为叶绿素丙酮溶液，做测定用。 测量光密度 ✓ 取直径为1 cm的比色杯，注入上述叶绿素丙酮溶液，另以 80％丙酮注入同样的比色杯中，作为空白对照，与663 nm和645 nm波长下读取光密度。 将测定得的光密度值代入公式（1）（2）（3）计算出 Ca、Cb及总Ct的质量浓度
5. 计算结果 叶片干重之差除以叶面积及照光 时数，即得光合作用强度。
结果分析
干重增加数（mg） 光合作用强度 = ————————————
切取叶面总和（dm2）×照光时数（h）
结果分析
1. 仔细观察和记录实验结果。 2. 计算出Ca、Cb及总Ct的质量浓度。 3. 计算今天菠菜中Ca、Cb及总Ct的含量。 叶绿素a的含量（mg/g鲜重）= 叶绿素b含量（mg/g鲜重）= 叶绿素c含量（mg/g鲜重）=
韩山师范学院生物系
植物生理学实验
实验六 植物光合强度的测定 （改良半叶法）
实验目的
熟悉在未分离的叶绿体色素溶液中测定 叶绿素a和b的方法及其计算。
测定叶绿素a和b的方法及其计算
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算一目的要求：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
二实验原理：如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1）OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2）式中：Ca为组分a的浓度，g/L。
Cb为组分b的浓度，g/L。
OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。
kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。
ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。
kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。
从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：将表中数值代入上式（1）、（2），则得：OD663=82.04×Ca+9.27×CbOD645=16.75×Ca+45.60×Cb经过整理之后，即得到下式：Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca=12.7 OD663-2.69 OD645 （3）Cb=22.9 OD645-4.68 OD663 （4）CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 （5）（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
实验七叶绿素ab含量的测定及植物光合强度的测定_OK
思考：NaOH能否直接放在称量纸上称量？为什么？
应如何操作？
33
3. 溶解 应在烧杯中溶解，不能在容量瓶中溶解。
思考：若量取的是浓硫酸需要稀释，应如何操作才
是正确的？
34
4. 转移 由于容量瓶瓶颈较细，为避免液体洒在外面，应用玻璃棒引流。
提问：将烧杯中的氯化钠溶液转移到容量瓶中，此时溶质是3否5 完 全被转移到容量瓶中？应如何处理？
5. 洗涤 用少量蒸馏水洗涤2～3次，洗涤液要全部转移到容量瓶中。 思考：如果用量筒量取液体药品，量筒要洗涤吗？
如果用量筒量取液体药品，量筒不必洗涤。 因为这是量筒的“自然残留液”，若洗涤后转移到容量瓶中会 导致所配溶液浓度偏高。 但是使用量筒时应注意选择的量筒与量取液体的体积相匹配。
36
6. 定容 向容量瓶中加入蒸馏水，在距离刻度1～2cm时，改用胶头
8
A663=82.04Ca+9.27Cb A645=16.75Ca+45.60Cb
Ca=12.7A663-2.69A645 Cb=2;Cb=20.2A645+8.02A663 (mg / L) 9
？
10
器材与试剂
➢ 实验仪器：研钵、漏斗、分光光度计、三角烧瓶 ➢ 实验试剂：丙酮、石英砂、碳酸钙 ➢ 实验材料：青菜叶片
实验七 叶绿素a、b含量的测定 及植物光合强度的测定
1
一、叶绿素a、b含量测定
2
实验原理
胡萝卜素
类胡萝卜素
（含量占1/4）
叶绿体色素
叶黄素 叶绿素a
叶绿素
（含量占3/4）
叶绿素b
3
分光光度法
根据叶绿素对某一特定波长的可见光具有吸收能力， 用Lambert- Beer定律计算出叶绿素的含量。
叶绿素a、b含量测定
叶绿素a、b含量测定【实验原理】如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：OD1=C a·k a1+C b·k b1（1）OD2=C a·k a2+C b·k b2（2）式中：C a为组分a的浓度，g/L；C b 为组分b的浓度，g/L；OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；k a1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值；k a2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值；k b1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值；k b2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值；从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：波长（nm）叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：OD663=82.04×C a+9.27×C bOD645=16.75×C a+45.60×C b经过整理之后，即得到下式：C a=0.0127 OD663-0.00269 OD645C b=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把C a，C b的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：C a=12.7 OD663-2.69 OD645（3）C b=22.9 OD645-4.68 OD663（4）C T= C a+ C b=8.02 OD663+20.21 OD645（5）（5）式中C T为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
叶绿素的测定
分光光度法测青菜中的叶绿素（食品化学）艾克拜尔艾海提 s100102105 食硕1003一、实验目的1. 掌握水果蔬菜等食品中的叶绿素测定原理与操作方法；2. 了解叶绿素a和b的性质及各自的最大吸收峰；3. 熟悉分光光度计的使用方法，了解其注意事项。
二、实验原理将青菜叶中叶绿素萃取到丙酮中，然后将溶于丙酮中的叶录素转移到乙醚中，在指定的波长下，测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度，然后根据公式计算青菜叶中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。
三、实验试剂碳酸钙，无水硫酸钠，85%丙酮，乙醚四、实验步骤1. 称取30g新鲜青菜叶置于组织捣碎机中，然后加入0.1gCaCO3和85ml丙酮，在高速组织捣碎机中，在转速20000r/min下捣碎2min破碎青菜叶组织。
2. 抽滤所得的匀浆，用少量85%丙酮多次洗涤残渣，直到残渣不带绿色为止，将溶液合并后用丙酮定容至500ml。
3. 吸取25ml叶绿素-丙酮溶液，加入到含有25ml乙醚的分液漏斗中，然后加入50ml水，观察到所有叶绿素都转入上层乙醚相中，放出下层水相。
4. 在另一只分液漏斗中加入50ml水，插入一只末端拉成小孔的玻璃管，将叶绿素-乙醚溶液注入玻璃管，溶液通过玻璃管末端小孔进入水相后再上升聚集在水相表面，入出下层水相，重复上述操作步骤五次，让溶于叶绿素-乙醚溶液中的丙酮转移到水相中。
将乙醚层转移至容量瓶中。
5. 将以上放出的下层水相合并，加入25ml乙醚，同上操作。
将所得乙醚层也转移至容量瓶中。
6. 用乙醚将叶绿素-乙醚溶液定容至100ml。
7. 用少量无水Na2SO4吸收叶绿素-乙醚溶液中的水分。
8. 在波长660.0nm 和642.5nm下，分别测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度。
五、数据处理1. 总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b（mg/L）的计算公式如下：总叶绿素=7.12A660.0+16.8A642.5叶绿素a=9.93A660.0-0.777A642.5叶绿素b=17.6A642.5-2.81A660.0式中A660.0和16.8A642.5分别代表波长660.0nm 和642.5nm测定叶绿素-乙醚溶液所得的吸光度值。
叶绿素a的测定(B)
内江市环境保护监测站实验报告分析人员：质量负责人：技术负责人：报告单位：内江市环境保护监测站报告日期：2010 年8月2日叶绿素a的测定（B）一、样品名称：叶绿素a编号：叶绿素a考核任务来源：四川省环保厅上岗考核组实验目的：四川省监测人员上岗考核实验日期：2010年7月27日报告日期：2010年7月27日二、实验目的叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素。
通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。
在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。
三、水样的采集与保存可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。
湖泊，水库采样500ml，池塘300ml，采样量视浮游植物的分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。
采样点及采样时间同“浮游植物”。
水样采集后应放置在阴凉处，避免日光直射。
最好立即进行测定的预处理，如需进过一段时间（4~48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0~4℃）避光处。
在没升水样中假如1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。
水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。
四、仪器设备（1）分光光度计（2）真空泵（3）离心机（4）乙酸纤维滤膜（孔径0.45ug）（5）抽滤器（6）组织研磨器或其他细胞破碎器（7）碳酸镁粉末（8）90%丙酮五、实验步骤(1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。
倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kpa）。
水样抽完后，继续抽1~2min，以减少滤膜上的水分。
如需段时期保存1~2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。
(2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6~8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2~3ml90%的丙酮，充分研磨，提取液绿色a。
用离心机（3000~4000r/min）离心10min。
将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。
叶片叶绿素含量的测定
叶片叶绿素含量的测定 The document was finally revised on 2021植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法1、原理叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：D663= +D645= + (浓度单位：g/mL）叶绿素a的浓度：Ca= –叶绿素b的浓度：Cb= – D663总叶绿素的浓度：Ct = + (浓度单位：mg/L）2、试剂与材料试剂：丙酮、石英砂、碳酸钙材料：新鲜叶片。
仪器与器皿：分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管3、实验步骤称叶用丙酮研磨↓匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）↓滤液用80%丙酮定容至25mL↓适当稀释后测A645、A663取样：称取剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。
注意取样时要避开大的叶脉。
研磨提取：向研钵中加入80%丙酮，以及少许（约）CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。
读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。
将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。
第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。
将仪器波长分别调至663、645nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述2个波长下的吸光度。
如何进行叶绿素含量测定(用丙酮法)
如何进行叶绿素含量测定（用丙酮法）［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。
吸收曲线彼此又有重叠，叶绿素a、b在D652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次（D652）而求出叶绿素a、b总量：CT=(D652×1000)/34.5根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1 (1)OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2 (2)Ca为组分a的浓度（g/L） Cb为组分b的浓度（g/L）OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值。
OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD 值。
ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。
叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表：波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1），（2）并整理的：Ca=0.01272OD663-0.00259OD645Cb=0.02288OD645-0.00467OD663若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca=12.72OD663-2.59OD645 (3) Cb=22.88OD645-4.67OD663 (4) Ct=Ca+Cb=8.05OD663+20.29OD645 (5)Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。
利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度（g/L）。
［器材与试剂］实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管实验试剂：丙酮，碳酸钙实验材料：植物叶片［实验步骤］1.取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.1G放入研钵中加80%丙酮少量，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，用80%丙酮定容至10ml。
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）
叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得：C A =13.7D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025??A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025??B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025??G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其
计算
一目的要求：
熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b 的方法及其计算。
二实验原理：
如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线
横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数
根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：
OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1）
OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2）
式中：Ca为组分a的浓度，g/L。
Cb为组分b的浓度，g/L。
OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。
kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。
ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD 值。
kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD 值。
从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：
将表中数值代入上式（1）、（2），则得：
OD663=82.04×Ca+9.27×Cb
OD645=16.75×Ca+45.60×Cb
经过整理之后，即得到下式：
Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645
Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663
如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：
Ca=12.7 OD663-2.69
OD645 （3）
Cb=22.9 OD645-4.68
OD663 （4）
CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21
OD645 （5）
（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b 及总叶绿素的浓度（mg/L）。
[附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而
叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。
此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差，不适用于测定。
751型有时也由于波长不够准确，会带来一定误差。
可用叶绿素对波长进行校正。
为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的需要量很少，用纸层析法很快就能分离制得。
取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。
然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有0.5%丙酮的石油醚。
层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。
最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。
三实验器材与试剂：
1．实验仪器高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管。
2．实验试剂丙酮、碳酸钙。
3．实验材料植物叶片。
四操作步骤：
1、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，将匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮定容至10ml，吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用。
2、测定光密度：取上述色素提取液4ml，转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。
3、按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。
再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。
【注意事项】
1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。
2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。
五作业：
1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素ab的比值有无不同。
2、分光光度法和比色法有何异同？
叶绿素a和b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和b的定量分析，为什么？
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。