测定叶绿素a和b的方法及其计算

实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其

计算

一目的要求：

熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b 的方法及其计算。

二实验原理：

如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。

图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线

横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数

根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：

OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1）

OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2）

式中：Ca为组分a的浓度，g/L。

Cb为组分b的浓度，g/L。

OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。

OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。

ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。

kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。

ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD 值。

kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD 值。

从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：

将表中数值代入上式（1）、（2），则得：

OD663=82.04×Ca+9.27×Cb

OD645=16.75×Ca+45.60×Cb

经过整理之后，即得到下式：

Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645

Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663

如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：

Ca=12.7 OD663-2.69

OD645 （3）

Cb=22.9 OD645-4.68

OD663 （4）

CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21

OD645 （5）

（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。

利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b 及总叶绿素的浓度（mg/L）。

[附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而

叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差，不适用于测定。751型有时也由于波长不够准确，会带来一定误差。可用叶绿素对波长进行校正。

为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的需要量很少，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有0.5%丙酮的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。

三实验器材与试剂：

1．实验仪器高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管。

2．实验试剂丙酮、碳酸钙。

3．实验材料植物叶片。

四操作步骤：

1、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，将匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮定容至10ml，吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用。

2、测定光密度：取上述色素提取液4ml，转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。

3、按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。

【注意事项】

1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。

五作业：

1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素ab的比值有无不同。

2、分光光度法和比色法有何异同？

叶绿素a和b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和b的定量分析，为什么？

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）