冻融土壤中碳、氮矿化测定实验方案

冻融土壤中碳、氮矿化测定实验方案
实验小组成员：黄永华，崔胜彬，钟昌建，倪祥银，兰彩霞实验还需物品及试剂：保鲜膜，保鲜袋，BaCl2，乙醇95％，酚二磺酸
一、实验指标：
1、单种土壤不同冻融循环次数后碳、氮矿化，酶活性以及微生物数量的测定
2、不同水分梯度土壤冻融循环后碳、氮矿化，酶活性以及微生物数量的测定
3、不同植被覆盖下的土壤冻融循环后碳、氮矿化的测定
二、实验方案：(内江全年温度范围-3℃—41℃)
土样的采集：选取内江周边有代表性的川东南紫土丘陵区土壤，在选定的样地内取样，取样时采用“S”取样法随机采集表层0～20cm土壤，5点组成一个土样。

将采集的8-10Kg土样除去动植物残体，编号后装入塑料保鲜袋，运回实验室分成两份。

土样的处理：将采回后的土壤在4℃培养待用
冻融循环及对照的设置：将土样在-2℃下培养24h，然后取出再在5℃培养24h，以此为一次冻融循环，即每冻融一次为48h。

冻融十次为一个冻融周期，共计480h（20d）。

对照组则在5℃的条件下一直培养直到实验组完成冻融循环。

一>土壤碳、氮矿化的测定方法：
(1)碳矿化的测定方法：取冻融处理后的土样设置3个平行样，每个样300g，
用去CO2蒸馏水调节土壤湿度至其最大持水量的60%，装在2000ml塑料瓶中。

在塑料瓶中放入装有20mlNaOH溶液(浓度0.1mol/L)的小烧杯，用以吸收有机碳矿化释放的CO2。

将塑料瓶密封后放入恒温箱中在5℃培养7天后取出NaOH溶液并用1mol/L BaCl2 2mL，再加入酚酞指示剂2滴，用浓度为0.05mol/L的HCl滴定至红色消失,同时做对照试验。

计算出CO2的释放量。

结果计算：CO2(ml/kg)={[(V0- V)* c *0.022*(22.4/44)*1000]*2*1000}/m 式中：V0 ——对照组滴定时消耗的标准盐酸体积，ml
V ——实验组滴定时消耗的标准盐酸体积，ml
c ——标准盐酸的浓度，mol/L
m ——土样的质量，g
试剂：0.1mol/L NaOH，1mol/L BaCl2，酚酞，0.05mol/L HCl，
(2)氮矿化的测定：
1）铵态氮的测定方法：（蒸馏滴定法）
土样10.0g加入2mol/L KCl 50ml震荡30分钟，过滤。

取滤液25ml放入
半微量定氮蒸馏器中。

将盛有2%硼酸液5ml的三角瓶放于冷凝管下方。

加入12%MgO 10ml于蒸馏室中，蒸馏。

10分钟后，三角瓶中的液体用
0.005mol/L H2SO4 滴定至紫红色为止，同时做对照试验。

试剂：2mol/L KCl，2%硼酸，12%MgO，0.005mol/L H2SO4
2）硝态氮的测定方法：（酚二磺酸比色法）
土样25.0g加入0.25g CaSO4.2H2O和100ml H2O，震荡10分钟，静置5
分钟后过滤。

取滤液40ml于蒸发皿中，加CaCO30.05g水浴蒸干，冷却，加入2ml酚二磺酸试剂，静置10分钟加水20ml，待蒸干物完全溶解并冷却以后缓缓加入NH4OH，将溶液转入100ml容量瓶中定容，在分光光度
计上波长420nm处比色。

试剂：0.25gGaSO4.2H2O，0.05g CaCO3，2ml酚二磺酸，NH4OH
3)土壤水分的测定和梯度的调整及其碳氮矿化的测定方法：
1)鲜土水分的测定：取新鲜土样M g，用烘箱烘干（3-5h）其重量变为m g，
则鲜土含水量W=(M-m)/m*100﹪；
2)鲜土水分梯度的调整：取相同质量（M=1000g）的新鲜土样五份，标记为
a、b、c、d、e分别做如下处理
土样鲜重g 加蒸馏水ml 干重g 含水量％((M+x)/m)
a M x1 ma
b M x2 mb
c M x3 mc
d M x4 md
e M x5 me
3)碳矿化的测定法：再对调节水分后的五份土样进行冻融循环一个周期，
作为对照的未做水分调节土样在5℃培养20d。

处理后的土样设置3个平
行样，每个样300g，装在2000ml塑料瓶中。

在塑料瓶中放入装有
20mlNaOH溶液(浓度0.1mol/L)的小烧杯，用以吸收有机碳矿化释放的
CO2。

将塑料瓶密封后放入恒温箱中在5℃培养7天后取出NaOH溶液并用1mol/L BaCl2 2mL，再加入酚酞指示剂2滴，用浓度为0.05mol/L的HCl 滴定至红色消失,同时做对照试验。

计算出CO2的释放量（计算方法同上）。

4)氮矿化的测定方法：碳矿化测定后做（方法同上）
4)单种土壤不同冻融循环次数后碳、氮矿化的测定
1)碳矿化：
a、对照组：置于5℃下培养20d。

b、实验组：土样分别在冻融循环第一、第三、第五、第七、第十次后取
一次样，每次取3塑料瓶，分别在每个塑料瓶中加入300g处理后的土样。

在塑料瓶中放入装有20mlNaOH溶液(浓度0.1mol/L)的小烧杯，用以吸
收有机碳矿化释放的CO2。

将塑料瓶密封后放入恒温箱中在5℃培养7
天后取出NaOH溶液并用1mol/L BaCl2 2mL，再加入酚酞指示剂2滴，
用浓度为0.05mol/L的HCl滴定至红色消失,同时做对照试验。

计算出
CO2的释放量（方法同上）。

2)氮矿化：碳矿化测定后做（方法同上）
二>酶活性的测定：
1)脲酶的测定:取5.00g测定碳矿化后的风干土样，置于50ml三角瓶中，
加1ml甲苯。

15min后加10ml 10％尿素液和20mlpH6.7柠檬酸缓冲液。

摇匀，37℃恒温培养24h。

过滤后取3ml滤液注入50ml容量瓶中，在
578nm处比色。

试剂：甲苯，10％尿素液，pH6.7柠檬酸缓冲液
2)蔗糖酶的测定：取5.00g测定碳矿化后的风干土样，置于50ml三角瓶
中，注入15ml 18％蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和0.2ml（5滴）
甲苯。

摇匀，37℃恒温培养24h。

迅速过滤，取1ml滤液注入50ml容
量瓶，加3ml3,5-二硝基水杨酸，沸腾水浴5min，自来水流冷却3min。

溶液生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，用蒸馏水定容至50ml。

在508nm处比色。

试剂：18％蔗糖溶液，pH5.5磷酸缓冲液，甲苯，3,5-二硝基水杨酸三>微生物数量的测定:菌液经过多次10倍稀释后，一定量菌液中可以极少或
无菌，选择5个连续的稀释度，每个稀释度取3个样重复接种于适宜的培养基中，培养后分别记载得出的数量指标就可以计算出单位土壤的菌体数目。

1)细菌的测定：采用稀释平板法，用牛肉膏蛋白胨培养基接种培养其10¯
3、10¯
4、10¯
5、10¯
6、10¯7五个梯度的土菌液，每个梯度取3个平行
样。

在30℃下培养5d，记录菌落数目。

测定单位土样菌液数目
2)真菌的测定：采用稀释平板法，用土豆液琼脂培养基接种培养其10¯3、
10¯4、10¯5、10¯6、10¯7五个梯度的土菌液，每个梯度取3个平行样。

在30℃下培养5d，记录菌落数目。

测定单位土样菌液数目
3)放线菌的测定：采用稀释平板法，用改良高氏一号培养基，临用前每
500ml加入3%的重铬酸钾1ml以抑制细菌和真菌的生长。

培养其10¯3、10¯4、10¯5、10¯6、10¯7五个梯度的土菌液，每个梯度取3个平行样。

在30℃下培养7d，记录菌落数目。

测定单位土样菌液数目
4)反硝化细菌的测定：
5)氨氧化细菌的测定：
操作步骤：
称取10.00g土样和上述90ml灭过菌的1mmol/L磷酸盐的缓冲液一起加
入到匀浆机中，搅拌30s或60s，然后转移至高压灭过菌的150ml三角
瓶中，摇匀后吸取10ml该稀释度为10-1的土壤悬浮液至另一只预先
灭过菌的装有90ml磷酸盐缓冲液的三角瓶中，摇匀，得到稀释度为10-2
的土壤悬浮液。

继续稀释至10-5.如果硝化细菌的数量较高，应进一步
稀释至10-6、10-7、或10-8.取5个连续的稀释度，将其分别接种到装
有4ml灭菌的液体培养基的试管中。

每管接种土壤悬浮液1ml，每个稀
释度重复接种5官，即每个土样共制备25个试管，同时设置不接种的
对照。

试管在20C—30C避光培养（培养箱中或合适的室温条件）21d
后，取试管进行初步观察，PH指示剂颜色由蓝绿色变为黄色表明发生
了氨的氧化。

为了确认NO2-生成，可用比色盘进行定性测试。

在无菌
条件下从试管中吸取0.1ml液体，放入比色盘凹槽中，先加入1滴重氮
试剂，然后加入1滴耦合剂，如果有品红至红色出现，表明有NO2-存
在，并与未接种的对照比较。

继续培养至少6周，每周检查一次颜色变
化，直到有NO2-反应的试管数量在最后两周不再增加为止。

培养结束
时，要对颜色较浅或没有颜色的试管进行NO2-的定性检测。

对没有
NO2-反应的试管，要用二苯胺试剂检测NO3-的含量，因为亚硝酸氧化
微生物有可能已将NO2-全部氧化为NO3-。

硝酸盐检测的灵敏度不如亚
硝酸盐高。

内江气候条件：内江市位于天府之国的东南部，座落在美丽富饶的沱江之滨。

东连重庆，西接成都，南通自贡、宜宾、泸州，北到遂宁、南充，是川东重镇、四川省规划建设的8个大城市之一。

地理位置东经104°15′--105°26′，北纬29°11′--30°2′。

内江历史悠久。

内江是开发较早的巴蜀腹心城市，东汉建县，曾称汉安、中江，隋文帝时改称内江，至今已有2000多年的历史。

1950年设内江专区，1985年改建省辖内江市。

1998年，经国务院批准，内江行政区划进行再次调整至今。

由于历史上盛产蔗糖，制糖业发达，素有"甜城"之称。

内江文化底蕴深厚。

内江素有"大千故里"、"文化之乡"的美誉，是川中文化发达地区之一。

自古以来，人文荟萃、才俊辈出，孔子之师苌弘、西汉辞赋家王褒、东汉教育家董均、宋代理学家陈抟、国画大师张大千、新闻巨子范长江、被孙中山授予四大将军之一的喻培伦大将军等都是内江彪炳史册的杰出代表。

内江市属亚热带湿润季风气候。

受盆地和本地自然环境的影响，具有气候温和、降雨量丰富、光热充足、无霜期长的特点。

内江冬季不冷，一月份的平均气温为6℃--8℃，极端最低温度-3℃；夏季也不太热，七月份的平均气温为26℃--28℃，但也曾出现过41℃的极端最高气温。

因此全年气温在-3℃—41℃之间，无霜期达330天。

灾害性天气以旱为主，旱涝常交替出现；
春夏秋冬，低温、风、暴雨时有发生，绵雨显著，同时，夏旱伏旱的现象也时有发生。

年降雨量在1000毫米左右，多分布在夏季，约占全年雨量的60％，高温期与多雨季基本一致，春季约占17％，冬季仅占4％。