原位杂交技术
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④ 牛血清白蛋白和载体DNA等 （阻断探针与组织非特异结合， ↓背景）
（complementary DNA） （长度为数百-数千碱基对）
☆ 双链cDNA探针是最常用的核酸探针 特别适用于基因表达的研究
☆ 双链cDNA探针—是克隆于质粒载体中的 特异cDNA分子
（针对某个蛋白质分百度文库—目的蛋白的编码序列）
制备克隆于质粒中的特异cDNA分子
简要过程： 从mRNA逆转录生成cDNA 构建cDNA文库（特异重组体的克隆） 筛选和克隆特异cDNA分子 最后克隆入质粒载体保存
标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP 等等
非放射性标记物
（荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等）
被导入某个单核苷酸而形成标记分子
如： 四甲基罗达明-UTP
生物素-UTP (Bio-UTP)
地高辛-dUTP (Dig-dUTP)
溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子
cDNA双链探针的优点：
⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较稳定，不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA探针
RNA是单链分子 （探针长度50-300碱基对）
优点： ⑴ 杂交效率比DNA探针高
⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定
⑶ 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链
2、标记方法 ⑴ DNA探针标记
⑵ RNA探针标记
⑶ 寡核苷酸探针标记
1. 标记物 放射性标记物：
放射性标记物 非放射性标记物
同位素
非放射性标记物 ：荧光素 生物素 地高辛等
标记分子：某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、 功能基团或侧链分子作为标记物， 对碱基配对不造成影响
放射性标记物
常用的同位素有： 35S、33P、32P 和 3H
DNA —— 可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体DNA或 病毒DNA
RNA —— 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的mRNA，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒RNA
（四） 原位分子杂交
1.杂交体 2.杂交条件 3.严格度的概念
1.杂交体 hybrids
DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA
变 性 DNA
复
变性的两条互补DNA单链在适当条件
性
下重新缔合成双链的过程称为复性
退火
复性可以发生在导致变性的高温下降的时 候，因此又将复性称为退火
(活细胞内的DNA在进行复制和转录时也存
在着变性和复性的过程)
原位杂交
以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
二、 杂交体的探测 （一） 放射自显影 （二） 免疫细胞化学
一、核酸分子杂交
DNA双链分子在一定条件下 可发生变性和复性的过程
变 双链DNA分子在一些因素作用 性 下两条链解离的过程称为变性
在高温、强酸或强碱等作用下，双链DNA分子空 间结构破坏，双螺旋解旋，双链之间的氢键和 疏水键也被破坏，最后两条链解离
1971年， Jacob 创立电镜原位杂交技术检测爪 蟾卵母细胞DNA
80年代，原位杂交技术飞速发展 现已能检测只有数百碱基对的较小分子 DNA和含量很低的mRNA
探针标记的发展 同位素 酶、荧光素、生物素、地高辛
※ 地高辛（digoxin）敏感性高，现广泛应用 （标记试剂盒）
第一节 原位杂交技术的原理※
使含有特异序列、经过标记的核酸单链即 探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸 单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免 疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在 细胞原位显示特异的DNA或RNA分子
101页
原位杂交技术的原理
一、 核酸分子杂交 （一）探针 （二）标记 （三）靶核酸分子 （四）原位分子杂交
原位杂交技术
in situ hybridization
原位杂交技术
杂交组织化学技术 原位杂交免疫细胞化学技术
原位杂交技术是将分子生物学与细胞 化学技术结合起来，以标记的核酸分子为 探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子 的技术
原位杂交技术的应用
对特定生理或病理条件下从DNA到mRNA 到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位 的分析，是研究基因表达强有力的手段
缺点： 容易受RNA酶的污染而被降解
3. 寡核苷酸探针
短链探针 (长度10-50个核苷酸)
这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成
优点：形成杂交体快速 （序列短链，杂交时易于穿透）
缺点：特异性较低（短链和简单）
（二） 探针标记
1、标记物 ⑴ 放射性标记物 ⑵ 非放射性标记物
2. 标记方法
酶法
将放射性或非放射性的标记分子 在各种酶促反应中参入探针分子
（1） DNA 探针标记
切口移位法 随机引物法
（2） RNA探针标记
在体外转录技术中与探针制备同时完成
（3） 寡核苷酸探针标记
末端转移法
（三） 靶核酸分子
靶分子（或靶序列）： 指所要探测的核酸分子或核苷酸序列 （DNA 或RNA）
再对其探测
利用已知的标记的核酸序列（ 探针） 去识别组织中待测的DNA 和 RNA
＋
↓
(一）探针
1 cDNA
2 RNA 3 寡核苷酸
原位杂交的探针是： 已知序列的分子或序列未知但分子已知的核 酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知 其针对何靶分子）
1. cDNA 探针
互补于mRNA的DNA分子
稳定性依次是： DNA-DNA ＜ DNA-RNA＜RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度 温度等
2. 杂交条件
（1）杂交液 （2）探针浓度（3）温度（4）pH （5）时间
（1） 杂交液
① 钠盐（杂交效率↑ 非特异反应↓）
② 甲酰胺（使杂交所需温度降低）
③ 硫酸葡聚糖（提高探针浓度）
如细胞遗传学，产前诊断，肿瘤，病毒学等 特别是将肿瘤的病因学、发病学、诊断学和 治疗学等方面的研究提高到基因水平
原位杂交技术的特点
光镜或电镜
在保持组织、细胞或染色体结构的条件 下在原位检测特异的核酸分子，这种定位能 够反应特异核酸分子与组织、细胞或细胞器 的关系
原位杂交技术的发展
1969年，Gall等人首次应用原位杂交方法检测 病毒DNA，核糖体DNA
（complementary DNA） （长度为数百-数千碱基对）
☆ 双链cDNA探针是最常用的核酸探针 特别适用于基因表达的研究
☆ 双链cDNA探针—是克隆于质粒载体中的 特异cDNA分子
（针对某个蛋白质分百度文库—目的蛋白的编码序列）
制备克隆于质粒中的特异cDNA分子
简要过程： 从mRNA逆转录生成cDNA 构建cDNA文库（特异重组体的克隆） 筛选和克隆特异cDNA分子 最后克隆入质粒载体保存
标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP 等等
非放射性标记物
（荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等）
被导入某个单核苷酸而形成标记分子
如： 四甲基罗达明-UTP
生物素-UTP (Bio-UTP)
地高辛-dUTP (Dig-dUTP)
溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子
cDNA双链探针的优点：
⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较稳定，不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA探针
RNA是单链分子 （探针长度50-300碱基对）
优点： ⑴ 杂交效率比DNA探针高
⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定
⑶ 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链
2、标记方法 ⑴ DNA探针标记
⑵ RNA探针标记
⑶ 寡核苷酸探针标记
1. 标记物 放射性标记物：
放射性标记物 非放射性标记物
同位素
非放射性标记物 ：荧光素 生物素 地高辛等
标记分子：某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、 功能基团或侧链分子作为标记物， 对碱基配对不造成影响
放射性标记物
常用的同位素有： 35S、33P、32P 和 3H
DNA —— 可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体DNA或 病毒DNA
RNA —— 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的mRNA，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒RNA
（四） 原位分子杂交
1.杂交体 2.杂交条件 3.严格度的概念
1.杂交体 hybrids
DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA
变 性 DNA
复
变性的两条互补DNA单链在适当条件
性
下重新缔合成双链的过程称为复性
退火
复性可以发生在导致变性的高温下降的时 候，因此又将复性称为退火
(活细胞内的DNA在进行复制和转录时也存
在着变性和复性的过程)
原位杂交
以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
二、 杂交体的探测 （一） 放射自显影 （二） 免疫细胞化学
一、核酸分子杂交
DNA双链分子在一定条件下 可发生变性和复性的过程
变 双链DNA分子在一些因素作用 性 下两条链解离的过程称为变性
在高温、强酸或强碱等作用下，双链DNA分子空 间结构破坏，双螺旋解旋，双链之间的氢键和 疏水键也被破坏，最后两条链解离
1971年， Jacob 创立电镜原位杂交技术检测爪 蟾卵母细胞DNA
80年代，原位杂交技术飞速发展 现已能检测只有数百碱基对的较小分子 DNA和含量很低的mRNA
探针标记的发展 同位素 酶、荧光素、生物素、地高辛
※ 地高辛（digoxin）敏感性高，现广泛应用 （标记试剂盒）
第一节 原位杂交技术的原理※
使含有特异序列、经过标记的核酸单链即 探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸 单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免 疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在 细胞原位显示特异的DNA或RNA分子
101页
原位杂交技术的原理
一、 核酸分子杂交 （一）探针 （二）标记 （三）靶核酸分子 （四）原位分子杂交
原位杂交技术
in situ hybridization
原位杂交技术
杂交组织化学技术 原位杂交免疫细胞化学技术
原位杂交技术是将分子生物学与细胞 化学技术结合起来，以标记的核酸分子为 探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子 的技术
原位杂交技术的应用
对特定生理或病理条件下从DNA到mRNA 到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位 的分析，是研究基因表达强有力的手段
缺点： 容易受RNA酶的污染而被降解
3. 寡核苷酸探针
短链探针 (长度10-50个核苷酸)
这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成
优点：形成杂交体快速 （序列短链，杂交时易于穿透）
缺点：特异性较低（短链和简单）
（二） 探针标记
1、标记物 ⑴ 放射性标记物 ⑵ 非放射性标记物
2. 标记方法
酶法
将放射性或非放射性的标记分子 在各种酶促反应中参入探针分子
（1） DNA 探针标记
切口移位法 随机引物法
（2） RNA探针标记
在体外转录技术中与探针制备同时完成
（3） 寡核苷酸探针标记
末端转移法
（三） 靶核酸分子
靶分子（或靶序列）： 指所要探测的核酸分子或核苷酸序列 （DNA 或RNA）
再对其探测
利用已知的标记的核酸序列（ 探针） 去识别组织中待测的DNA 和 RNA
＋
↓
(一）探针
1 cDNA
2 RNA 3 寡核苷酸
原位杂交的探针是： 已知序列的分子或序列未知但分子已知的核 酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知 其针对何靶分子）
1. cDNA 探针
互补于mRNA的DNA分子
稳定性依次是： DNA-DNA ＜ DNA-RNA＜RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度 温度等
2. 杂交条件
（1）杂交液 （2）探针浓度（3）温度（4）pH （5）时间
（1） 杂交液
① 钠盐（杂交效率↑ 非特异反应↓）
② 甲酰胺（使杂交所需温度降低）
③ 硫酸葡聚糖（提高探针浓度）
如细胞遗传学，产前诊断，肿瘤，病毒学等 特别是将肿瘤的病因学、发病学、诊断学和 治疗学等方面的研究提高到基因水平
原位杂交技术的特点
光镜或电镜
在保持组织、细胞或染色体结构的条件 下在原位检测特异的核酸分子，这种定位能 够反应特异核酸分子与组织、细胞或细胞器 的关系
原位杂交技术的发展
1969年，Gall等人首次应用原位杂交方法检测 病毒DNA，核糖体DNA