植物生物技术报告

绿色荧光蛋白转入拟南芥愈伤组织

引言：

拟南芥与油菜、萝卜、卷心菜等同为十字花科植物，作为一种草本植物广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部。在我国的内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有生长。近一百年来，随着生物学和经典遗传学的蓬勃发展，科学家们逐渐注意到它的研究价值。长期以来，科学家一直希望在植物中找到像动物中的黑腹果蝇那样繁殖快、易于在实验室培养、适于遗传操作的实验材料，进而从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。

拟南芥植株较小（一个8cm见方的培养钵可种植4-10株）、生长周期短（从发芽到开花约4-6周）、结实多（每株植物可产生数千粒种子）。拟南芥的形态特征分明，莲座叶着生在植株基部，呈倒卵形或匙形；茎生叶无柄，呈批针形或线形。侧枝着生在叶腋基部，主茎及侧枝顶部生有总状花序，四片白色匙形花瓣，四强雄蕊。长角果线形，长约1-1.5cm，每个果荚可着生50-60粒种子。这些特点使得拟南芥的突变表型易于观察，为突变体筛选提供了便利。拟南芥是典型的自交繁殖植物，易于保持遗传稳定性。同时，可以方便的进行人工杂交，利于遗传研究。

拟南芥的另一个优点是易于转化。经过不断的实践，浸花法（floral tip）已成为拟南芥转化最常用的方法。对生长5-6周已抽苔的拟南芥打顶来促进侧枝生长，待花序大量产生时将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡几分钟，3-4周后对转化植株收种子。在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为研究人员建立突变体库、改变目的基因的表达特征以及开展互补验证等实验提供了便利。

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，简称GFP）是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表，生存历史超过1.6亿年，正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光，是因在其包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸）残基，可自发地形成一种荧光发色团。GFP作为一种报告基因还具有无种属特异性、分子量小、容易与其他蛋白形成融合蛋白、不损害细胞、易检测、可用于活体观察等特点[1]。

一、实验原理

1.培养拟南芥愈伤组织

愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。

愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。

配制培养基：选用1/2MS培养基对种子进行培养。MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染[2]。配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。

2.实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下：

①培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下：压力9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min。

②玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌

③塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌

④金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。

⑤接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。超净工作台：紫外灯照射，70%—75%的酒精擦洗。

⑥外植体灭菌：水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次备用。

3.农杆菌转化

农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。根癌农杆菌含有Ti (tumor-inducing plasmid)质粒Ti 质粒上的 T-DNAtransferred DNA在 Vir区virulence region基因产物的介导下可以插入到植物基因组中诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此 将外源目的基因插入到 T-DNA 中借助 Ti质粒的功能使目的基因转移进宿主植物中并进一步整合、表达。

根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA(T-DNA)，具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括:

①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。

②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。

③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。

④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，况且其不能合成起诱导作用的信号分子，所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用。不过近年来大量成功转化的实例表明，植物、真菌、哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T-DNA 区域完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功激活处于反式位置上的T-DNA的转移。另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基因或Lac Z基因等。双元载体系统的转化原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA 的转移。

根据受体材料不同分为浸花法、原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。其中浸花法、叶盘法在许多植物上得到广泛应用。

二、实验目的

1. 学习并掌握拟南芥愈伤组织的置备方法。

2. 学习并掌握制备感受态农杆菌的方法。

3. 学习并掌握重组质粒转入农杆菌的方法。

4. 学习并掌握农杆菌转入拟南芥愈伤组织的方法。

5.复习荧光显微镜的使用方法。

三、实验过程

1.培养拟南芥愈伤组织

1.1所需材料准备

拟南芥种子若干，70-80%酒精，无菌水，2,4-D（2mg/L），6-BA（1mg/L），MS固体培养基（琼脂糖7.2g/L），三角瓶；黑暗培养箱；培养皿；无菌滤纸；无菌镊子；保险膜等

1.2培养拟南芥愈伤组织[3]

选取饱满、无霉变、成熟拟南芥种子。将拟南芥种子置于1 .5 ml离心管中，加入1 ml 蒸馏水，4C纯化水3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml 三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。（短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。）此处获得无菌苗的时间有异议，应该为2--3周。

2.将重组质粒转入农杆菌

选用pCAMBIA1304质粒

所需材料准备(注：因为农杆菌的培养周期较长，一定要保证有28度摇床可用。) 菌种：农杆菌EHA105利福平抗性,LB液体培养基3ml 50ml,LB固体培养基利福平和卡那抗性,抗生素：利福平50mg/ml和卡那抗性50mg/ml,CaCl220mmol/L,液氮,液体YEP培养基,涂布棒，枪头，滤菌膜，平板，锥形瓶，3ml液体培养及用管，1.5ml离心管，水浴锅，离心机，培养箱，摇床等

制备感受态农杆菌

挑取1个新鲜的单菌落到含3ml LB培养基中利福平浓度50 mg/L；28℃，200 r/min 振荡培养过夜取0.5ml菌液加入50ml培养基中利福平浓度50mg/L ；28℃，200r/min振荡培养至培养液OD600=0.50取1.5ml菌液转移至预冷的1.5ml离心管中，冰浴30 min；4℃，5000 r/min 离心10 min，弃上清，重复取菌液3-4次，完成后将离心管倒置于灭菌滤纸上使其残液流尽；缓慢向离心管中加入20

mmol/L冰预冷的CaCl2转化溶液1ml，重悬菌液沉淀，冰浴中放置10 min，4℃，5000 r/min离心10min；弃上清，加入100ul 20 mmol/L的冰预冷的CaCl2转化溶液，重悬菌液沉淀。

重组质粒导入农杆菌

在感受态细胞中加入重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；液氮速冻1min；迅速移至37℃融化，加入900ul液体培养基，28℃轻摇培养4h；6000r/min离心2min，弃上清；用100ul培养基重悬菌体，重悬液体后涂布于含利福平50mg/L和50mg/L 卡那霉素的固体培养基上，28℃倒置培养2d；挑取单菌落，接种到液体YEP培养基上，28℃，230r/min培养48h，菌液用于保存或转化。

3.将农杆菌转入拟南芥愈伤组织

所需材料准备

(注：诱导培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8-6.0

共培养培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1 +AS 100 uM·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8

选择培养基：MS+2,4-D 2 mg·L-1 +羧卞青霉素250 mg·L-1+潮霉素

50mg·L-1+6-BA 1mg·L-1；PH =5.8-6.0)

LB固体培养基（利福平和卡那抗性）,含100μM/L乙酰丁香酮的AAM培养基,无菌培养瓶,羧卞青霉素(100 mg/mL),潮霉素,无菌滤纸,无菌水,AAM培养基,共培养基：MS培养基;选择培养基

将农杆菌转入拟南芥愈伤组织

处理农杆菌：从低温(－20℃) 冻存管中取少量菌液于附加Kan 50 mg/L和Rif 50 mg/L LB固体培养基，然后在26-28℃暗培养两天。

农杆菌感染拟南芥：农杆菌在27℃固体LB培养基上暗培养2天后，用适量添加有100μM/L乙酰丁香酮的AAM培养基，将农杆菌洗脱，悬浮于添加有100μM/L 乙酰丁香酮20 ml AAM培养基中，剧烈摇动，调整菌液浓度至OD600nm=0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，28℃中暗培养2天。

洗脱农杆菌：两天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。第二天转移至选择培养基(添加250 mg/L羧卞青霉素，以及50 mg/L潮霉素)筛选抗性愈伤。

4.荧光显微镜观察结果

取转化后的愈伤组织制片，放在荧光显微镜下观察实验结果。

四、实验结果与讨论

1.实验结果

在培养愈伤组织的过程中多次出现杂菌，且没有生成愈伤组织。并且在后来的多次诱导过程时向诱导培养基中加入了适量的抗生素，虽然解决了杂菌生长的问题，但是仍然没有愈伤组织生成。愈伤组织培育失败，实验不能继续完成。2.讨论

愈伤组织培养时引入杂菌的可能有：没有严格按照实验室无菌操作要求操作，例如只戴手套，不戴口罩不穿实验服操作；使用无菌工作台之前不进行彻底的消毒操作；培养箱公用，打开太频繁，易导致染菌；与其他组一起培养，易相互感染等。

愈伤组织诱导失败可能的原因可能有：次氯酸钠处理后没有用无菌水洗净，

抑制了脱分化过程；2-4 D在培养基中由于高温或其他原因导致其终浓度不对或者2-4 D已经失效。

五、参考文献

[1]王爱民,高霞莉，根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

[2]陈敏，白书农，拟南芥培养经验点滴．植物生理学通讯，2005，31:436～438

[3]刘守伟，刘士勇，拟南芥室内培养技术研究[J].山西大学学报（自然科学版）2009，SI01，46～43