腈水解酶催化腈水解的研究进展_刘颖

腈水解酶催化腈水解的研究进展

刘颖，苏昕*1

（沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，沈阳 110016）

摘要:腈水解酶催化具有毒性、致畸性、致癌性的腈水解合成羧酸因其反应条件温和、成本低、环境污染少及高选择性（立体、化学、区域）而备受学者和企业家的青睐，产物羧酸广泛用于精细化工、医药中间体、维生素前体等，具有高增值价值，因此腈水解酶具有良好的工业应用前景和巨大的经济价值。目前对腈水解酶的来源、作用机制、筛选途径、酶结构、催化特性以及腈水解酶基因克隆、纯化、固定化、修饰等研究均有报道。参考20余篇文献，本文综述腈水解酶催化腈类化合物水解的研究进展。

关键词：腈水解酶，腈化合物，生物催化

Advances in nitrilase hydrolyzing nitriles

LIU Ying, SU Xin*

(School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China) Abstract: The nitrilases attract substantial attention from scholars and entrepreneurs because of their mild reaction conditions, low-cost, small environmental pollution and high selectivity (stereo-, chemical-, regional-) when hydrolyzing toxic, mutagenic and carcinogenic nitriles. The production of carboxylic acid with high added value is widely used in fine chemicals, pharmaceutical intermediates and vitamin premises. Therefore, the nitrilase has good application prospect and the great economic value. Articles about the sources of enzyme, mechanism, screening approach, structure, catalytic properties, nitrilase gene cloning, purification of nitrilase, immobilization, modification etc have been reported. Based on more than 20 domestic and foreign literatures, recent progress on nitrilases hydrolyzing nitriles was reviewed.

Keywords: Nitrilase, Nitriles, Biocatalysis

腈是一类含−CN基团的有机物，是合成酰胺、羧酸、酯等的起始原料。它们不仅种类繁多而且自然界中分布广泛，如用作溶剂的乙腈、高聚物的单体丙烯腈、杀虫剂溴苯腈和碘苯腈、微生物和植物中产生的蓖麻碱等[1]。大多数腈化合物具有毒性、致畸性、致癌性[2]，但由其水解得到的羧酸被广泛应用于精细化工、医药中间体及维生素前体等，具有较高的增值价值。腈的化学水解反应条件苛刻（高温、高压、强酸或强碱）且伴随有大量盐类形成，为后续的分离纯化带来困难，也造成一定的环境污染[3]，因此在工业上的应用有一定局限性。腈水解酶( EC 3.5.5.1)直接催化腈生成相应羧酸，虽存在活性低、稳定性差等缺点，但其作为卓越的生物催化剂因反应条件温和、环境污染少、成本低、高选择性而备受学者和企业家的关注（见图1）。

基金项目：沈阳市科学技术计划项目（项目号：F11-243-1-00）

作者简介：刘颖（1989-）女，硕士，从事生物转化研究。E-mail:ailsaly@sina.,cn

通讯作者：苏昕（1966-）女，副教授，博士，主要从事转基因植物、生物转化及抗菌药物的研究。

E-mail:suxin1966@

图1 腈水解酶相关文献及专利数量

Fig.1 Number of publications on nitrilase research

Articles were assessed according to Web of Science. Patents were assessed according to Espacenet

search conducted at the end of March 2013.

1 腈水解酶来源

腈水解酶的研究已有50年的历史，该酶最初由Thiman和Mahadevan从大麦叶中分离出，该纯化酶可催化吲哚乙腈、3-氰基吡啶等26种不同的腈化合物水解生成相应的羧酸[4]。此后，相关研究者们通过以特定的腈化合物为唯一碳源或氮源的富集培养或基因组数据挖掘等技术，在细菌、真菌及植物中均有发现腈水解酶。据不完全统计，已发现的腈水解酶来源近50种[5-6]。

2 腈水解酶的底物专一性

不同来源的腈水解酶对脂肪腈、芳香腈或杂环腈、芳基乙腈具有不同程度的偏爱性。源于Rhodococcus rhodochrous K22的腈水解酶偏向于水解脂肪腈[7]，3或4位被羟基、醛基、氨基、甲基等基团单取代的苯甲腈衍生物是Rhodococcus rhodochrous J1中腈水解酶的最适底物[8]，Alcaligenes faecalis JM3、Pseudomonas putida MTCC5110和Alcaligenes faecalis ZJUTB10 [9-11]产生的腈水解酶对芳基乙腈具有较高催化活性。

同一来源的腈水解酶性质也不尽相同。Bradyrhizobium japonicum USDA110中存在blr3397 和bll6402两种腈水解酶基因，二者编码蛋白质的氨基酸序列相似度达31%，但腈水解酶性质截然不同。首先,尽管二者均可催化苯乙腈，腈水解酶blr3397对3-苯基丙腈有最高酶活，扁桃腈是腈水解酶bll6402的最适底物，后者催化扁桃腈的活性（24.38U/mg）是前者的263倍；其次，腈水解酶blr3397催化部分脂肪腈的活性与催化苯乙腈的活性相近，腈水解酶bll6402催化脂肪腈的活性远远小于芳香腈的。最后，二者最大的区别在于腈水解酶bll6402可区域选择性水解脂肪二腈合成ω-氰基羧酸，而腈水解酶blr3397无此性质[12]。

同一种类的腈水解酶对相同底物的性质又有所不同。Alcaligenes faecalis ATCC 8750 和Alcaligenes faecalis JM3中的腈水解酶均为芳基乙腈水解酶,但二者在底物专一性和酶活方面具有显著差异，前者作用底物主要是苯乙腈及其α位被羟基取代或苯环上对位被卤素、硝基等取代的衍生物，而后者对丙烯腈、间-氯苯乙腈、2-噻吩乙腈等具有很高的活性[13]。

3 腈水解酶结构与功能的关系

活性位点附近氨基酸种类影响酶活和立体选择性。Christoph Kiziak[14]等报道的Pseudomonas fluorescens EBC191中的腈水解酶以较低的立体选择性催化外消旋扁桃腈并伴随副产物生成。该课题组设计一系列165位突变体即Ala被Trp、Phe、Tyr、His等较大氨基酸取代，试验结果显示165位含有芳香基团的取代氨基酸有利于减少酰胺的形成。设计的A165H突变体最为显著，其催化外消旋扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸的e.e.由野生型酶的31%增加到91%，副产物S-扁桃酰胺的量由19%降低到6%。