血凝原理基础
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125mg/dl
OD2
62mg/dl
PT
OD2
OD x [FIB]
PT
OD1
OD1
时间
0
62
125
250
浓度
mg/dl[FIB]
Instrumentation Laboratory
FIB的检测方法
Clauss法FIB的基本原理
Intrinsic
Extrinsic
Common
浓缩凝血酶
纤维蛋白原
反应曲线
典型的曲线像一个大的
S
有一个初始的基线,一个上升阶段和一个终 点 (平台期)
Instrumentation Laboratory
反应曲线
吸光度变化 平台期; 所有的纤维蛋白原均 已转化为纤维蛋白 纤维蛋白原正在转化为 纤维蛋白 时间
初期; 凝血因子激活期
Instrumentation Laboratory
Instrumentation Laboratory
发色底物法(如:抗凝血酶试验)
标本与肝素(外源性)一同孵育。 过量的FXa 加入。 过量的FXa水解加入的底物。 pNA产生。
AT + Heparin [AT*Heparin] + FXa (excess) Chromogenic substrate
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Antithrombin %
Instrumentation Laboratory
免疫比浊法,D-二聚体检测
Instrumentation Laboratory
免疫学百度文库法
D-Dimer Curve
Instrumentation Laboratory
光学检测法
凝固反应
测量浊度的变化 它并不是一种由于颜色变化引起的吸收值的变 化(区别于发色底物法) 为了避免干扰(胆红素,血红蛋白),通常选 择高波长进行检测
Instrumentation Laboratory
胆红素,血红蛋白和乳糜在检测时吸收峰位置
乳糜 血红蛋白
胆红素
Other
Other
PT衍生纤维蛋白原(PT based FIB )
Clauss法纤维蛋白原(Clauss FIB)
Instrumentation Laboratory
FIB的检测方法
PT based FIB的基本原理
– 基于PT反应曲线光学差值与FIB浓度的线性关系
OD
250mg/dl
OD
PT
OD3 OD3
Thrombin XIIIa XIIIa
Thrombin activates FXIII
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
XIIIa
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
Instrumentation Laboratory
血凝检测原理
Instrumentation Laboratory
仪器检测原理
• 凝固法(凝块形成) • 发色底物法 (吸光度变化) • 免疫比浊法 (乳胶粘合)
Instrumentation Laboratory
仪器检测项目
凝固法 PT,APTT,TT,FIB(PT-Based & FIBClauss), Factors II, V, VII, X, VIII, IX, XI, XII, Protein C, Protein S, APC-R, LAC,PCX,HPX 发色底物法 Anti-thrombin,Heparin(普通&低分子), Plasminogen, Plasmin Inhibitor, 免疫比浊法 D-Dimer, vWF(活性及含量), Free Protein S,VIII含量,HS-CRP
Instrumentation Laboratory
发色底物法
Antithrombin: Neat plasma 100%, diluted at 50 % and 25%
Instrumentation Laboratory
发色底物法
AT Linearity
0.7 0.6
A 405 nm-490 nm
Instrumentation Laboratory
光学法检测
持续检测光密度变化 (透射法或散射法) 凝固时间由数学运算法则决定 (域值, 第一演 算法,第二演算法等)
Instrumentation Laboratory
仪器的运算法则决定反应时间
最经典的运算法则:
阈值,正好能产生特定效应的界限(反应浊度的
ACL
波长
Instrumentation Laboratory
凝固法检测史
Instrumentation Laboratory
手工法检测
反应在试管内发生(37° C水) 凝块形成,操作人员肉眼可见 操作人员记录时间
Instrumentation Laboratory
手工法检测
Instrumentation Laboratory
运算法则: 一阶导数法
一阶导数
应用于以下情况:
Example: Recombiplastin; 凝固曲线上升很快, 凝固曲线的形状清晰, 凝固时间较长 (与阈值法 或二阶导数法比较) 一阶导数的曲线总是正的 (or zero)
Instrumentation Laboratory
运算法则: 二阶导数法
一阶导数法
It is established that the maximum speed of the reaction represents the clot point
Time 凝固点
Instrumentation Laboratory
运算法则: 一阶导数法
一阶导数的真实表现
Instrumentation Laboratory
凝固法
660 散射比浊 405 吸光率
880 透射比浊 405 吸光率
671 透射比浊 405 吸光率
发色底物法
乳胶 凝集试验
405
405
405 or 671
Electra = 550 for clotting and 405 for chromogenic
Instrumentation Laboratory
时间:S 20 15 10 1 0 55
2 5
纤维蛋白
[FIB]∝凝固时间
浓度:mg/dL
1
Instrumentation Laboratory
FIB方法使用建议
首选Clauss方法—NCCLS推荐 如考虑测试成本,可选用PT based FIB做常规 筛查,超出200-400mg/dL范围样品及OAT病 人样品用Clauss法复查
血凝常规检测
血浆或稀释血浆 (37°C孵育) + 试剂 (预加热 37°C) -> 纤维凝块形成 -> 纤维凝块形成所需时间
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白凝块检测
所有的凝固反应均为纤维凝块形成过程的检测 如: PT, APTT, Fibrinogen Clauss, 因子检测, 等
正在研发的实验项目:· · · · · ·
Instrumentation Laboratory
From ACL 100 to ACL 10000 to ACL Elite
Photo-optic method: IL instrumentation
ACL Futura ACL Advance ACL Top
XIIIa
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
XIIIa
FXIIIa stabilises fibrin by introducing covalent bonds
Instrumentation Laboratory
ACL系列凝血仪纤维蛋白原检测
运算法则: 阈值法
阈值法
应用于下列情况:
Example: 纤维蛋白原Clauss; delta信号弱, 当 FIB浓度高时,曲线上升快,而浓度低时曲线 上升缓慢。在某些标本中逆向检测的阈值用于 曲线的末端是非常平坦的。
Instrumentation Laboratory
运算法则: 一阶导数法
浊度或光 散射值
实际上,大部分凝固反应运算使用的是二阶 导数。 少许情况下使用一阶导数。 其它一些反应使用阈值法更合适。 不同的运算法则由不同的试验所选择。
Instrumentation Laboratory
发色底物法
发色底物试验
发色底物试验的基本反应是: 未稀释血浆或稀释后血浆(incubated at 37°C) + 试剂 (酶) ->中间复合物 + 试剂(底物) 剩余的酶能水解特殊的底物, 去除pNA 分子 ,产生颜色反应。
纤维蛋白的形成过程
2. 纤维蛋白单体自发聚合
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
2. 纤维蛋白单体自发聚合
Fibrin fibre
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
2. 纤维蛋白形成纤维蛋白网
Fibrin net
Instrumentation Laboratory
g b a
the formula is: 2(a,b,g)
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
纤维蛋白原转变为纤维蛋白通过三个步骤 1. 蛋白水解(通过凝血酶)
Thrombin Fibrinopeptide A
Fibrinopeptide B
Thrombin Thrombin
结论:
凝固曲线和反应曲线是一个良好 的工具 。 这种工具为确保可靠的结果提 供保障,既节省时间,又节省 费用。
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
Fibrinogen is composed of 3 chains 纤维蛋白原分子的每一条链由两部分组成
g b a
[AT*Heparin] [AT-FXa- Heparin] + FXa (residual) Peptide + pNA
FXa (residual)
Instrumentation Laboratory
Chromogenic Method
pNA呈黄色,随后被分光光度计测量 (at 405 nm). 测量值与定标曲线比较得出浓度值。
变化) 第一法则 (反应速度) 第二法则 (反应加速度)
Instrumentation Laboratory
运算法则: 阈值法
浊度或 光散射值
浊度阈值法用于 (曲线delta的绝 对值或百分比)允许识别凝固点
阈值法 (凝固起始点)
Time 凝固点
Instrumentation Laboratory
Instrumentation Laboratory
Clause 方法与PT 衍生法结果比较 口服抗凝药病人
标本: 411 正常人, 50 位口服抗凝药病人 方法: Clauss 和PT 衍生法 结果: Clauss PT derived 正常人 320±124 289±126 (mg/dl) 口服抗凝药病人421±154 487±194 (mg/dl) 口服抗凝药病人PT 衍生法结果比 Clause 法高24%
浊度或 光散射值 反应的最大加速度点 二阶导数
Time 凝固点
Instrumentation Laboratory
运算法则:二阶导数法
二阶导数法的真实表现
Instrumentation Laboratory
运算法则: 二阶导数法
二阶导数法
用于以下情况: 基线不总是平坦的 通常情况下反应加速度快 凝固曲线信号清晰,在基线和凝块形成期无起 伏 该运算法则主要应用于凝固反应试验(i.e. APTT type)
Instrumentation Laboratory
运算法则: 二阶导数
二阶导数
通常应用于下述情况:
Example: APTT; 凝固曲线相对清晰,反应加 速度快, 曲线外观没有大的起伏。 二阶导数曲线可正可负。
Instrumentation Laboratory
凝固曲线
一种完善的算法是否存在 ?
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
XIII
Thrombin
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
Thrombin XIII
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白
Fibrinogen
凝血酶水解纤维蛋白肽 纤维蛋白单体
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
2. 纤维蛋白单体自发聚合
Instrumentation Laboratory
纤维蛋白的形成过程
2. 纤维蛋白单体自发聚合
Instrumentation Laboratory