瓜氨酸的发酵生产

湖北大学

发酵工程与设备课程设计

题目：瓜氨酸的发酵生产

专业年级：11级生物工程

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指导老师：

2014年 5月 24日

目录

1前言

1.1瓜氨酸性质

瓜氨酸( citrulline)，又名氨基甲酰鸟氨酸( carbamyl ornithine) ，L-瓜氨酸分子式为C6H13N3O3，分子量175.19，纯品为白色结晶或结晶粉末，有酸味微溶于水，不溶于乙醇和乙醚。瓜氨酸的熔点为222℃，等电点为5. 92，比旋光度为[α] D25= 21. 0。瓜氨酸最先由右贺太郎等在1914年从西瓜榨汁中分离得到，此后由和田光德确认为一种氨基酸。[ 1]除了西瓜汁中含有瓜氨酸之外，野西瓜叶、核桃仁、核桃幼苗及种子中都含有瓜氨酸。瓜氨酸是一种非蛋白质α-氨基酸，它具有肽键形成的能力，但是很少参与蛋白质的合成，仅存在于人类的少数几种蛋白中，包括丝集蛋白、中间丝集蛋白[2]、人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）、聚角蛋白微丝蛋白及一些组蛋白。

瓜氨酸结构式：

1.2瓜氨酸的应用

瓜氨酸在人体内代谢途径：

1.2.1防治前列腺疾病瓜氨酸对防治前列腺疾病,包括前列腺炎、前列腺肿胀、前列腺肥大、前列腺增生症、前列腺癌作用明显。

1.2.2治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病和提高男性性功能研究表明, 瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸L-精氨酸和一氧化氮, 产生的L-精氨酸可以弥补食物中L-精氨酸的缺乏；一氧化氮会活化酵素，导致平滑肌舒张，使人的血管获得松弛，在维持心血管正常功能也发挥着重要作用[ 3, 4]，同时也可以用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。

1.2.3抗衰老和增强免疫力研究发现瓜氨酸有较强的抗氧化能力, 能够清除羟基, 增加精氨酸合成所需的NO, 可有效保护DNA 及PMN免受氧化反应的侵害[5] , 可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品,也可作为女性美容化妆品, 具有护肤防皱祛斑抗衰老之功效。

1.2.4提高运动员肌肉力量与耐力精氨酸对于人体的运动机能有良好的促进作用, L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体, 在许多组织中能转化成L-精氨酸, 服用瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力, 维护健康的心肺功能, 提高脑力清晰度, 降低压力和克服沮丧情绪, 平衡血糖浓度, 增强人体的肌肉强度, 提高体能, 在运动保健方面具有良好的作用。

1.2.5其它作用除了以上应用，瓜氨酸还可以用作异体排斥效应指示剂, 诊断类风湿关节炎[6 ]等。

1.2.6与瓜氨酸相关的疾病与瓜氨酸相关的疾病有类风湿关节炎，瓜氨酸是RA（RA是一种以关节滑膜炎为特征，以多发性关节炎为主要临床表现，进而导致关节畸形、功能障碍的常见致残性疾病）患者血清中抗丝集蛋白相关抗体

识别的主要抗原决定簇成分[2]。瓜氨酸血症，瓜氨酸血症是因为尿素循环中的精氨酸琥珀酸合成酶(ASS) 缺陷所致,患者血、尿及脑脊液中瓜氨酸均升高,由于尿素循环受阻引起高氨血症。[7]

1.3瓜氨酸的国内外生产及研究现状

1.3.1瓜氨酸生产方法

1.3.1.1化学法化学法是被最早应用的生产瓜氨酸的方法，目前为止也是生产瓜氨酸最主要的方法。化学法生产瓜氨酸是指在碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体DL-瓜氨酸，影响产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境，化学法生产也因此受到限制。国内还报道过以L-鸟氨酸盐酸盐为原料与碱式碳酸铜反应生成二鸟氨酸合铜保护α-NH2, 用尿素对α-NH2 进行甲酰化, 得到二瓜氨酸合铜, 后用H2S除铜离子得到L-瓜氨酸[8]。

1.3.1.2提取法由于天然产物中瓜氨酸含量极其有限，因此提取法受到原料来源限制，生产规模小，工艺较复杂，分离提取困难，产酸率低，成本高，经济效益差等缺点都严重限制了提取法在工业生产上的应用。但相对于传统方法，提取法能得到天然瓜氨酸，因此找到一种广泛生长的富含瓜氨酸的植物也是一种很好的研究方向。

1.3.1.3发酵法发酵法是生产天然瓜氨酸的一种比较普遍的方法。欧美对于这方面的研究报道比较多，方法也较成熟。尤其是日本对这方面的研究比较深入。Okumura等[9]用Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)发酵生产瓜氨酸；日本Kyowa Hakko Kogyo公司[10]培养能够利用烃类作为碳源的石蜡节杆菌Arthrobacter paraffineus精氨酸需求型的突变株发酵生产瓜氨酸。

1.3.1.4酶法酶法生产瓜氨酸采用Streptococcus faecalis，Clostridium perfringens，Micrococcus pyogenes，Bacillus pyocyaneus，Baker’s yeast[11~13]微生物生产的精氨酸分解酶，精氨酸脱亚氨基酶，由精氨酸生产瓜氨酸。酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反应，因而可避免瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。Chibata等[14]报道Pseudomonas putida ATCC4359，Pseudomonas fluorescen IFO 3081，Pseudomonas ovalis IAM 1002，Leuconostoc citrovorum ATCC 8081等可以生产精氨酸脱亚氨基酶，以L-精氨酸或DL-精氨酸为底物，得到较高浓度瓜氨酸。曹瑜等[15]利用粪链球菌精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸制备L-瓜氨酸。进而有报道采用固定化粪链球菌酶法连续生产L-瓜氨酸[16]，该法可连续化生产, 大大提高生产效率，降低了生产成本。

1.3.1.5化学-生物法刘毅等[17]用化学-生物法制备D-精氨酸和L-瓜氨酸，通过添加催化剂，快速消旋为DL-精氨酸。后以DL-精氨酸为底物，利用酶

法同时制备D-精氨酸和L-瓜氨酸。D-精氨酸参与组成的多肽，可抑制癌症扩散，治疗生长激素释放过多造成的紊乱，还具有抑制DNA 合成、前列腺癌细胞增殖等功能。

2发酵工艺

瓜氨酸发酵可以采用Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)、粪链球菌(Streptococcus faecal)[18]或者能够利用烃类作为碳源的石蜡节杆菌Arthrobacter paraffineus精氨酸需求型的突变株，传统上采用研究透彻的生长条件易控制的枯草芽孢杆菌[19]或黄色短杆菌进行L-瓜氨酸发酵。

本课程设计题目以枯草芽孢杆菌为发酵菌种进行探究瓜氨酸的发酵工艺。

瓜氨酸发酵采用通用的微生物液体发酵技术，工艺流程及发酵设备也基本相同。

2.1发酵工艺流程