水体样本提取的方法

水体样本提取的方法

手提

（细菌细胞直径约0.5um，长度约0.5~5um）

将300-500ml水样通过0.45um或者0.22um的滤膜

如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5um孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，滤膜孔径大于水体微生物细胞直径。

用于水体微生物富集的滤膜的选择：

常用的滤膜孔径大小有45mm和22mm两种，孔径太小滤膜容易阻塞，45mm的孔径大小透水性较好，提样的时候可根据客户的需要，选择45mm或22mm孔径的滤膜。

滤膜材质有很多种，常用的三种为聚苯醚砜滤膜、混合纤维素酯薄膜、氧化铝薄膜。

聚苯醚砜滤膜（Polyethersulfone）：最结实的滤膜之一，可以过滤比其它滤膜更多的水样。使用真空泵可快速抽干，易于折叠不易撕破。能抵受真空泵长时间高压力的滤过。若需要过滤大量低微生物含量的清亮水样，0.22mm滤膜的更合适。在提取核酸时，得率可与PowerWater® DNA 和RNA Isolation Kits中自带的混合纤维素酯滤膜相媲美。

混合纤维素酯滤膜（膜醋酸纤维素、硝酸纤维素）: 0.45μm孔径最合适材质。如果水样浑浊，使用0.22μm滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm孔径的滤膜。纤维素滤膜吸水性强，不好处理。有文献显示杀虫剂和除草剂很容易吸附到纤维素滤膜上。若样品含有杀虫剂和除草剂，最好避免使用这类滤膜。

聚碳酸酯滤膜（Polycarbonate）: 这种滤膜很薄且容易起褶皱，所以不太好用。通常用0.45μm孔径的滤膜来预防过滤时发生阻塞。不像聚醚砜膜（PES）和混纤膜（MCE），水样中微生物会停留在滤膜表面。使得滤膜很容易阻塞，本该滤过的小颗粒也会截留下来。实验证明，珠磨研磨破碎强度越小，获得DNA分子量越大。如果样品只是用来做PCR，可以采用强力的研磨方法提高得率，暂时忽略片段破碎。

样品富集之后按照以下方法进行提取：

1. 滤膜剪碎，溶于500ul水中，液氮反复冻融（或用超低温冰箱）（从-70℃拿出来后在65℃水中冻融，小心操作，防止管子炸裂）【裂解细胞】

2. 将水样于13000rpm下离心，10min，收集沉淀

3. 沉淀溶于100ul 1×TE，重悬

4. 加入30ul溶菌酶（工作浓度50mg/ml）37℃1h

5. 加入500ul SDS（10%），及10ul蛋白酶K（20mg/ml），37℃过夜

6. 加入200ul 5mol/l 氯化钠

7. 加入预热至65℃的 CTAB/NaCl 100ul，65℃ 1h

8. 加入等体积酚氯仿 13000rpm 10min，两次，将上清移至新管

9. 加入等体积异丙醇 -20℃防止1h，13000rpm 30min

10. 70%乙醇清洗一次，自然晾干溶于30ul无菌水中

试剂盒

MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit

FastDNA® Spin Kit for Soil（MP bio土壤基因组DNA提取试剂盒）