CRISPR-Cas9基因敲除小鼠

合集下载

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为一种强大的工具，用于在生物医学研究中精确地编辑基因组。

DUSP9基因作为一种重要的基因，其功能在多种生物学过程中起着关键作用。

因此，构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，对于研究DUSP9基因的功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。

本文旨在详细介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程。

二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞（mESCs）、CRISPR-Cas9系统、相关基因编辑工具、培养基、生长因子等。

2. 方法（1）设计CRISPR-Cas9系统：根据DUSP9基因的序列信息，设计合适的CRISPR-Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。

（2）制备mESCs细胞：培养mESCs细胞至合适的状态，以便进行基因编辑。

（3）转染与编辑：将CRISPR-Cas9系统转染至mESCs细胞中，利用Cas9蛋白对DUSP9基因进行切割。

（4）筛选与鉴定：通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法，筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并进行鉴定。

三、实验过程1. 设计并构建CRISPR-Cas9系统，选择合适的sgRNA序列和Cas9蛋白表达载体。

2. 培养mESCs细胞至合适的状态，进行转染。

3. 观察转染后的细胞生长情况，确保Cas9蛋白的表达。

4. 利用PCR、Western blot、qRT-PCR等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞。

5. 对筛选出的细胞进行扩增培养，并保存于液氮中备用。

四、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了CRISPR-Cas9系统，并将其转染至mESCs 细胞中。

（2）成功筛选出敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法进行了鉴定。

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。

它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。

本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。

二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。

2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。

三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。

通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。

2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。

3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。

随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。

4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。

将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。

四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。

基于CRISPRCas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建

38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。

方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。

结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。

结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。

关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。

使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案

使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。

利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。

只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。

特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。

随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。

使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。

2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。

图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。

通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。

（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。

2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。

默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。

浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。

生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。

例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。

《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究领域，基因编辑技术日益显示出其巨大的潜力和应用前景。

CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已在多个物种中成功用于构建基因敲除模型。

本文旨在介绍如何利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供参考。

二、材料与方法1. 材料（1）小鼠胚胎干细胞（mESCs）；（2）CRISPR-Cas9系统相关试剂；（3）DUSP9基因敲除载体；（4）显微操作设备及试剂；（5）实验动物（小鼠）。

2. 方法（1）设计并构建DUSP9基因敲除载体；（2）将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂；（3）利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复，形成基因敲除突变；（4）筛选并扩增基因敲除的mESCs；（5）将基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，生成转基因小鼠。

三、实验过程1. 载体构建及转染首先，设计并构建DUSP9基因敲除载体。

该载体应包含靶向DUSP9基因的识别序列、切割位点及修复模板。

随后，将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂。

此过程需在显微操作下进行，确保转染效率和准确性。

2. CRISPR-Cas9系统修复及筛选利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复。

通过非同源末端连接或同源重组等方式，使基因发生突变，形成DUSP9基因敲除的突变体。

随后，通过PCR、测序等方法筛选并扩增基因敲除的mESCs。

3. 转基因小鼠生成及鉴定将扩增得到的基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，通过胚胎移植技术生成转基因小鼠。

随后，通过PCR、免疫组化等方法对转基因小鼠进行鉴定，确认DUSP9基因是否成功敲除。

四、结果与讨论1. 结果利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除的小鼠胚胎干细胞系。

通过PCR、测序等方法验证了DUSP9基因的敲除效率及准确性。

《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究中，基因敲除是一种重要的技术手段，能够精确地操控特定基因的表达，进而研究基因在生物体中的功能。

近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因敲除技术得到了极大的推进。

本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和步骤，为进一步研究DUSP9基因的功能提供技术支持。

二、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，具有高效、精确的基因编辑能力。

该系统通过设计特定的RNA 引导序列与Cas9蛋白结合，形成复合物，识别并切割靶点DNA 序列，从而实现基因的敲入、敲除或替换等操作。

三、DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的构建1. 靶点设计：首先需要确定DUSP9基因的敲除靶点，设计相应的sgRNA和Cas9蛋白序列。

通过分析DUSP9基因的序列，找到合适的位置作为靶点。

2. 胚胎干细胞系的获取：选取适合的小鼠胚胎干细胞系，确保其处于稳定的生长状态。

3. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑：将设计好的sgRNA和Cas9蛋白通过特定的方式（如质粒转染、病毒载体等）引入小鼠胚胎干细胞中。

在细胞内，sgRNA和Cas9蛋白形成复合物，识别并切割DUSP9基因的靶点。

4. 克隆筛选和鉴定：经过一段时间的培养和筛选，挑选出发生基因突变的小鼠胚胎干细胞克隆。

通过PCR、测序等分子生物学手段，鉴定克隆中DUSP9基因的敲除情况。

5. 细胞系建立：将鉴定成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞进行传代培养，建立稳定的细胞系。

四、实验结果与讨论通过上述步骤，我们成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系。

在实验过程中，我们观察到CRISPR-Cas9系统对DUSP9基因的切割效率较高，成功获得了多株基因敲除克隆。

《基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠》

《基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠》基于CRISPR-Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠一、引言近年来，基因编辑技术在生物学及医学研究领域取得了重大突破。

其中，CRISPR/Cas9技术以其高效、精确的基因编辑能力，在构建基因敲除模型、研究基因功能以及疾病机制等方面发挥了重要作用。

本文旨在介绍基于CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠的实验过程、结果及分析。

二、材料与方法1. 材料（1）细胞系：选择适合进行基因编辑的细胞系。

（2）小鼠：选择适合的实验用小鼠。

（3）CRISPR/Cas9系统：包括Cas9蛋白、sgRNA等。

（4）实验试剂与设备：包括细胞培养试剂、PCR仪、显微镜等。

2. 方法（1）设计并合成针对KDM2A和S100A9基因的sgRNA。

（2）构建CRISPR/Cas9表达载体。

（3）将表达载体转染至细胞系或小鼠胚胎中。

（4）筛选并扩增基因敲除细胞系或小鼠。

（5）通过PCR、 Western blot等方法验证基因敲除效果。

三、实验结果1. KDM2A基因敲除细胞系的构建与验证（1）成功构建了针对KDM2A基因的CRISPR/Cas9表达载体，并转染至细胞系中。

（2）通过PCR和Western blot等方法，验证了KDM2A基因的成功敲除。

（3）KDM2A基因敲除细胞系在体外培养过程中表现出特定的生物学特性改变。

2. S100A9基因敲除小鼠的构建与验证（1）将CRISPR/Cas9表达载体注射至小鼠胚胎中，成功获得了S100A9基因敲除小鼠。

（2）通过PCR等方法，验证了S100A9基因的成功敲除。

（3）S100A9基因敲除小鼠在生长过程中表现出特定的表型变化。

四、讨论与分析1. KDM2A基因敲除细胞系的分析KDM2A是一种组蛋白去甲基酶，参与调控基因表达和细胞周期等过程。

CRISPR_Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠_谷振阳

基因第三外显子碱基序列，设计针对 S1PＲ5 基因的 sgＲNA（ single guide ＲNA），构建 sgＲNA 表达质粒，利用 T7 ＲNA
聚合酶体外转录 sgＲNA 和 Cas9 后，将 Cas9 mＲNA 和 sgＲNA 对 C57BL /6 小鼠的受精卵进行显微注射。使用 T7E1
S1PＲ5 表达的 qPCＲ及 Wstern blot 检测颈椎脱臼法处死 F2 代 S1PＲ5 － / －的 C57BL /6 小鼠和野生型小鼠，后分别取出的脾脏，40 μm 滤网中充分研磨脾脏，收集脾脏细胞悬液，离心后，裂解红细胞。后收集脾脏细胞，提取总ＲNA 和总蛋白，并逆转录获得 cDNA，作为模板。利用引物ＲT-S1PＲ5 － F： 5'-CTACAACTACACCGGCAAGC-3'，ＲT-S1PＲ5 －Ｒ： 5'-TAGGATGTTGGTGGCGTAGG-3'，扩增目的基因。以 GAPDH 作为内参，比较 S1PＲ5 － / －小鼠与野生型小鼠中 S1PＲ5 在 mＲNA 水平的表达情况。以 S1PＲ5 的抗体（ Abcam 公司），actin 为内参，比较两种小鼠中 S1PＲ5 在蛋白水平的表达情况。
基金项目：国家自然科学基金面上项目（ 81270642） # 谷振阳和赵小利为共同第一作者． * 通讯作者：高春记，主任医师，教授，博士生导师． E-mail： gaochunji @ hotmail． com 2015 － 09 － 01 收稿； 2015 － 11 － 11 接受
·1156·
材料和方法
质粒构建 C57BL /6 小鼠中 S1PＲ5 基因 exon3 外显子上选择 sgＲNA（ single guide ＲNA）靶点，共设计 4 条 sgＲNA，分别是 S1PＲ5 （ 1 ）－ sgＲNA： 5'-ATAACCTCACTC ACCGGCGC-3'，S1PＲ5（ 2）－ sgＲNA： 5'-CTACACCGGCAAGCTCCGCG-3'，S1PＲ5 （ 3 ）－ sgＲNA： 5'-AAC ATGGGCGCATGGAAGCG-3'，S1PＲ5 （ 4 ）－ sgＲNA： 5'-TTTGTCGGACCTGCTCGCCG-3'，然后合成含此 4 种 sgＲNA 的双链寡核苷酸链，连入经酶切回收的 sgＲNA 表达载体，构建 sgＲNA 表达载体。测序验证连入的片段是否正确，后选择正确的克隆，培养后提取质粒，作为体外转录的模板。此过程由南京大学－南京生物医药研究院负责实施。

Cas9 TALEN CRISPR条件性敲除小鼠的原理

条件性敲除小鼠的原理
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。

Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。

传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。

传统方法，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。

第二步，通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。

在细胞水平上，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别 LoxP位点将抗性标记基因切除；在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。

一般需要一年以上的时间，价格在15-20万不等。

华夏凯奇基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似，差别在于华夏凯奇利用Optimized Cas9/CRISPR System(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列，可以快速获得Loxp 位点插入的小鼠。

目前我们一般只需要4-5个月。

价格也比传统方法大大降低。

CRISPRCas基因敲除小鼠

结语
谢谢大家！
• 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
2020/12/5
4
Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转录可被诱导
荧光蛋白
2020/12/5
5
转入Cas9后与野生小鼠对比
2020/12/5
6
神经系统荧光对比
2020/12/5
7
三种实验测试效果：
荧光显示含有 Cre/Cas9的组织中NeuN表达明显减少，而非转入非目标的sgRNA则目标蛋白无影响
15
NeuN被破坏的比例十分大
2020/12/5
Indel=insertions(插入) and deletions(删除) 16
多数为两个等位基因都被破坏，且其中多为移码突变。
2020/12/5
2020/12/5
23
最终肺中出现肿瘤
2020/12/5
24
2020/12/5
25
总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中，可以大大扩展Cas9的用途。
• 以后用此学作出贡献。
2020/12/5
26
Thanks！
2020/12/5
2
CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
2020/12/5
target
3
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚胎层面的实验。
• 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。

基因敲除小鼠的方法

基因敲除小鼠的方法
1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种高效的基因编辑工具，可以用来精确地敲除小鼠基因。

首先，科学家设计合成一段RNA序列，使其与目标基因序列相匹配，然后将这段RNA和Cas9蛋白复合体导入小鼠胚胎内。

复合体会通过识别并切割目标基因，导致基因敲除。

2. 胚胎干细胞技术，另一种常见的基因敲除小鼠方法是利用胚胎干细胞。

科学家可以将设计好的基因敲除载体导入小鼠胚胎干细胞中，使其发生基因敲除。

然后，这些修改过的干细胞可以被植入小鼠胚胎内，从而产生基因敲除小鼠。

3. 遗传改造小鼠技术，除了CRISPR/Cas9和胚胎干细胞技术，科学家还可以利用遗传改造技术来实现基因敲除。

这种方法涉及到选择性育种和杂交，通过选择性地交配和繁殖，最终得到具有特定基因敲除的小鼠品系。

总的来说，基因敲除小鼠的方法主要包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、胚胎干细胞技术和遗传改造小鼠技术。

这些方法都是在实验室条件下进行的，需要经过严格的实验设计和操作流程，以确保
基因敲除的准确性和有效性。

同时，这些方法也为科学家提供了强大的工具，用于研究基因在生物体内的功能和作用机制。

用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案

双基因敲除小鼠繁殖工作：CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。

假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。

得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠：方案一：1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子（AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。

2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25%的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。

3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交，在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。

方案二：将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。

然后将aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图右。

需要特别注意的几个问题：1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除纯合子小鼠很难；2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。

在开始setup breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCRassays 准备好；3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长发育等。

基因敲除小鼠的实验流程

基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。

一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。

2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。

一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。

3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。

筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。

4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。

5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。

6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。

7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。

利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。

8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。

嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。

9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。

可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。

基因敲除鼠的构建方法

基因敲除鼠的构建方法
基因敲除鼠是一种重要的遗传工具，它们能够帮助科学家们研究基因在生物学过程中的作用。

基因敲除鼠构建方法主要包括以下步骤： 1. 设计基因敲除鼠的目标基因序列，选择合适的外显子或内含
子进行靶向敲除。

2. 制备CRISPR/Cas9系统，包括Cas9蛋白、sgRNA以及质粒载体等。

3. 将CRISPR/Cas9系统导入到鼠胚胎干细胞中，使用
CRISPR/Cas9系统导致目标基因的敲除。

4. 鉴定敲除鼠胚胎干细胞中基因敲除的效率，通过PCR、Western blot等方法验证敲除效果。

5. 将基因敲除鼠胚胎干细胞注入到新生小鼠的内脏器官进行移植，培养出基因敲除小鼠。

基因敲除鼠的构建方法是一项复杂的工程，需要科学家们对基因编辑技术的熟练掌握和实验经验。

通过基因敲除鼠的研究，科学家们能够更加深入地了解基因在生物体内的作用，为疾病治疗和新药研发提供更为有效的手段。

- 1 -。

《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文

《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言基因编辑技术为现代生物学研究带来了巨大的突破。

在众多基因编辑技术中，CRISPR-Cas9系统以其高精度、高效率的特性备受关注。

本篇论文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程、结果以及相关讨论。

二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞系、DUSP9基因序列信息、CRISPR-Cas9系统相关试剂等。

2. 方法（1）设计并合成针对DUSP9基因的CRISPR-Cas9系统指导RNA（gRNA）。

（2）将gRNA与Cas9蛋白共同转入小鼠胚胎干细胞中。

（3）通过PCR、Western Blot等方法检测DUSP9基因的敲除情况。

（4）对敲除后的胚胎干细胞进行扩增、培养，并分析其生物学特性。

三、实验结果1. DUSP9基因敲除效率分析通过PCR和Western Blot等方法，我们成功检测到DUSP9基因的敲除情况。

在转导了CRISPR-Cas9系统的胚胎干细胞中，DUSP9基因的敲除效率达到了XX%。

2. 胚胎干细胞的生物学特性分析通过对敲除后的胚胎干细胞进行扩增、培养，我们发现其增殖能力、分化能力等生物学特性均与野生型胚胎干细胞无显著差异。

3. 基因敲除小鼠模型的构建与验证将敲除DUSP9基因的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，成功构建了DUSP9基因敲除小鼠模型。

通过对小鼠进行基因检测，验证了DUSP9基因的敲除情况。

四、讨论本实验利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为进一步研究DUSP9基因的功能及其在相关疾病中的作用提供了有力工具。

同时，本实验也证明了CRISPR-Cas9系统在基因编辑领域的广泛应用和可靠性。

在实验过程中，我们注意到以下几点：首先，gRNA的设计与合成是影响基因敲除效率的关键因素之一，需要针对目标基因的序列信息进行精确设计。

一文教你如何利用CRISPRCas9技术建立小鼠敲除模型

一文教你如何利用CRISPRCas9技术建立小鼠敲除模型作者：Ryan来源：科研小助手公众号Manipulation of mouse genome with minimal off-target by microinjection of one-cell embryos with paired sgRNAs and nickaseWhile CRISPR/Cas9 technique has been widely used in genome editing regarding multiple organisms, the off-target effect can’t be neglected. Subsequently, to conquer the off-target effect, many strategies have been applied including longer sgRNA (about 26bp) and nickase combined with paired sgRNAs. Here we described a good menthod for generating the mutant mice/conditional knockout mice with minimal off-target by microinjection of one-cell embryos with paired sgRNAs and Cas9 nickase. Moreover, paired sgRNAs and nickase can also mutate multiple genes simultaneously, or to generate large deletions up to at least 10kb or more.Comparison of Cas9 and nickase (Cas9D10A)Figure 1. Cas9 nickase strategy. Cas9 nickase induces a double strand break adjacent CRISPR sites (TS1 and TS2) onopposite DNA strands. Constrastly, single-stand nicks at off-target sites (OTS) for either sgRNA will be corrected by the base-excision repair pathway, thus minimizing off-target mutations. P, PAM site.Plasmidsused in the protocolT7-Nickase(Cas9-D10A):T7-sgRNA:ReagentsPlasmids: T7-Nickase(Cas9-D10A) and T7-sgRNAmMESSAGE mMACHINE®T7 Ultra kit (Ambion, AM1345)MEGAshortscript TM Kit(Ambion, AM1354)RNeasy Mini Kit (QIAGEN,74104)MEGAclear TM Kit(Ambion, AM1908)RNAsecure TM Reagent(Ambion, AM7005)QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN, 27104)MiniElute PCRPurification Kit (QIAGEN, 28004)BsaI (NEB, R0535S)AgeI (NEB, R0552S)DraI (TAKARA, D1037A)T4 DNA Ripid ligation Kit(NEB,M2200S)PMSG (Sansheng, China,50IU/ml in normal saline, Aliquot and store at -80℃)HCG (Sansheng, China,50IU/ml in normal saline, Aliquot and store at -80℃)EmbryoMax® Injection Biffer (Millipore, MR-095-10F)ProteinaseK(Merck,1245680100, 20 mg/ml in water, Aliquot and store at -20℃)Lysis buffer (10 μMTris-H Cl, 0.4 M NaCl, 2 μM EDTA, 1% SDS) Phenol (Tris-saturated),Chloroform and alcoholPCR clearing Kit (Axygen,AP-PCR-50)T7EN1 (NEB, M0302L)PrimerSTAR HS DNA Polymerase (TAKARA, DR010A)pMD19T-vector kit(TAKARA, 3271)EquipmentCentrifuge(RT and 4℃)VortexOneDrop OD-1000+ SpectrophotometerThermocyclerThermomixerThermo-controlledwater bath(37℃,42℃ and 58℃)ProcedureConstructionof sgRNA expression vectors1. Design of paired sgRNA oligos.Select paired sgRNAs in a tail-to-tail orientation and separated by 10-30 bp, which have the sequence 5’-CCN(52-72)GG.All possible paired sites for mouse and human exons are available on website(/htgt/wge/). For each sgRNA, the 5’-GGN(19)GGmotif is preferred, however, 5’-GN(20)GG or 5’-N(21)GG are also satisfactory. BLAT or BLAST the sgRNA target sites in UCSC or ENSEMBL genome browsers to find those with few or no highly related sites in the genome.Order oligos as below:For 5’-GGN(19)GGmotifTop strand oligo:Bottom strand Oligo:For 5’-GGN(20)GG motifFor 5’-GGN(21)GG motif2. Annealing oligos prior to cloning.4.5μl Top Oligo (100 μM)4.5μl Bottom Oligo (100 μM)1μl NEB buffer 2Annealing oligos using a thermocycler with the following program:95℃,5 min; 95-85℃ at -2℃/s; 85-25℃ at -0.1℃/s; hold at 4℃.3. Preparation of T7-sgRNA plasmid.2 μg T7-sgRNA plasmid.1 μl CutSmart Buffer1 μl BsaIAdd H2O up to 50 μl and incubate at 37℃ for 2 h with occasional shake.Purify the digeston product using MinElutePCR Purification Kit.4. Ligation of annealed oligos with BsaI-digested T7-sgRNA4 μl annealed oligos2 μl (25 ng/μl) digested T7-sgRNA10×NEB ligation buffer 1 μlddH2O 2 μlNEB T4 DNA ligase 1 μlUp to 10 μlncubate at 22℃for 30 min5. Transformation and plate on Kan+plate (50 μg/ml).6. Confirm correct Insertion of sgRNA oligosby sequencing using M13-47 primer.7. Mini-prep T7-sgRNA plasmid using QIAprepSpin Miniprep Kit.Transcriptionof sgRNAs in vitro1. Ensurethat reagents, tubes and tips are RNase-free and that the work is done in aribonuclease-free enviroment.2. Digestpaired sgRNA plasmids with DraI and purify the digestion fragment.10 μg paired sgRNA plasmids (5 μg each)10 μl 10×Mbiffer5 μl DraI (15 U/μl)Add H2O up to 100 μl and incubate at 37℃ for 3 h with occasional shake.Check plasmids were digested completely bygel electrophoresis, loading 2 μl in 1% agarose gel.Two bands (1621 and 1152 bp) will beobserved. It is not necessary tio gel-purify the band harboring the sgRNAsequence.Add 4 μl RNAsecure and incubate at 60 ℃ for 10 min in a thermomixer.Purify and elute the digestion product with 10 μl RNase-free water usingMinElute PCR Purification Kit, 5-8 μg of DNA will be recovered.For mutiplexing experiments, two or more paired sgRNAs may be digested simultaneously in one tube.Alternatively, the transcription template containing the T7 promoter sgRNAsequence may be prepared by PCR amplification from a bacterial colony using thefollowing primers and PCR program:sgRNA-For:5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGsgRNA-Rev:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCProgram:94℃,5min; ((98 ℃ ,10s; 72-62℃, -1℃/cycle, 15s; 72 ℃, 30s) 10 cycles, (98℃, 10s;62 ℃, 15s; 72 ℃, 30s) 25 cycles); 72 ℃, 5 min; hold at 4℃.Inactivate RNases byadding RNA secure and purify the PCR product using the MinElute PCR PurificationKit.3. Invitro transcription of sgRNAs using MEGAshortscriptTMKit.1 μl T710× Reaction Buffer1 μl T7 ATP Solution (75 mM)1 μl T7 CTP Solution (75 mM)1 μl T7 GTP Solution (75 mM)1 μl T7 UTP Solution (75 mM)4 μl purified template (more than 2 μg for plasmids, 700 ng-1000 ng for PCR products)1 μl T7 Enzyme Mix10 μl of transcription volume is OK.Incubate the reaction at 37 ℃ for 4-6 h in water bath or Thermocycler (Set thehot lid to 50 ℃).Add 1 μl TURBODNase and incubate at 37 ℃ for 15 min to remove the DNA template.4. Purify the sgRNAs by MEGAclearTM Kitaccording to the manufacturer’s instructions.RNA elutionoption 2 in the manual is preferred.Precipitatewith 5 M Ammonium Acetate and ethanol.Resuspendthe pellet using the 30 μl RNase free water.20-50 μgRNA will be obtained depending on the quality of DNA template.5.Assess sgRNA yield using the One Drop OD-1000+Spectrophotometer (or equivalent) and sgRNA quality by gel electrophoresis. RNAis loaded in DNA loading buffer and run on 1% agarose gel (180 V for 10 min).6.Aliquot and store at -80 ℃. The sgRNAs are stablefor one year without freeze-thaw cycles.Transcription of Nickase (Cas9-D10A) in vitro1. Ensure that reagents, tubes and tips are RNase-freeand that the work is done in a ribonuclease-free enviroment.2. Digest T7-Nickase (Cas9-D10A) plasmid with AgeIandpurify the digestion product.10 μgT7-Nickase (Cas9-D10A)10 μl NEBbuffer I4 μl AgeIAdd H2O upto 100 μl and incubate at 37 ℃ for 3 h with occasional shake.Add 4 μlRNAsecure and incubate at 60 ℃ for 10 min in a thermomixer.Check for complete digestion of the plasmid byelectrophoresis, loading 2 μl in 1% agarose gel.Purify and elute the digestion product with 10 μlRNas e-free water using MinElute PCR Purification Kit, 5-8 μg DNA will berecovered.3.In vitro transcribe Cas9-D10A using mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit according to the manufacturer’s instruction.4. Purify the Nickase (Cas9-D10A) mRNA by RNeasy MiniKit ac cording to the manufacturer’s instructions.5. Assess sgRNA yield using the One Drop OD-1000+Spectrophotometer (or equivalent) and sgRNA quality by gel electrophoresis. RNAis loaded in DNA loading buffer and run on a 1% agarose gel (180V for 10 min).A yield of 30-60 μg mRNA is expected.Note: Due to the size of the Nickase (Cas9-D10A) mRNA, no visible size shift is seenafter poly-A tailing. The mRNA quality is good if a smear is not observed.6. Aliquot and store at -80 ℃. Nickase (Cas9-D10A)mRNA is stable for one year without freeze-thaw cycles.Collection of zygotes1. Superovulate 4-week-old female C57BL/6J (about12-14g) mice by intraperitoneal injection with PMSG (5 IU/100 μl) at 14:00 ofday 1 and with HCG (5 IU/100 μl) at 13:00 of day 3.2. Cross superovulated females with males (C57BL/6J orCBA).3. Identify plugged females at 9:00 of day4. Collectone-cell embryos as decribed in Reyon, D. et al, 2012.Preparation of microinjection mixture1. Thaw aliquot of the Cas9-D10A mRNA and sgRNAs onice. Dilute the Cas9-D10A mRNA with Embryo Max® Injection Buffer to a concentration of 20 ng/μl and sgRNAs (5 ng/μl each) in a final volume of 50 μl. Pipette the mixture upand down several times2. Centrifuge at 4 ℃ for 1 min at top sped, andcarefully transfer 45 μl supernatant to a new tube. Always keep the tube onice.Microinjection and embryo transferMicroinjection and embryo transfer are performed using standard methods for generation of transgenic mice as described in Andras,N. et al., 2003, Cold Spring Harb Protoc. We prefer to inject the RNA mixture into both the cytoplasm and larger (male) pronucelus.Genotyping founders1. Tail tips from founders (5-day-old) are collected and digested overnight at 55 ℃ with lysis buffer containing 100 μg/ml Proteinase K. Genomic DNA is extracted by phenol-chloroform and purified by ethanol precipitation.2. Target region(300-700 bp) are PCR amplified from genomic DNA and the products are purified with the PCR Cleanup Kit. Purified PCR products are denatured and reannealed in NEB buffer 2 in a thermocycler using the following programme;95℃,5 min; 95-85 ℃ at -2℃/s; 85-25 ℃ at -0.1℃/s; hold at 4℃.3. Hybridized PCR products are digested with 0.5 μlT7EN1 at 37℃ for 30 min and separated by 2% agarose gel. Mutant founders will yield lower molecular weight cleavage bands.4. Cloning and sequencing of PCR amplicons from genimic DNA of mutant founders is used to characterize the mutations. T-A cloning of PCR products us performed using the pMD19T kit (TAKARA) according to manufacturer’s instructions.TroubleshootingProblemSolution SgRNA expression plasmid does not contain insertpUC57-sgRNA vector is not digested completely.Extend the incubation time and shake thedigestion product occasinally. Colony PCR canbe used to identify the positive coloniesusing 5’-TTGTACTGAGAGTGCACCATATG-3’ and the bottom strand sgRNA oligoLow yield of sgRNAsa. Use the recommended kits to improve the quality of plasmids and templateb. Increase the amount of template or use the PCR product as template. Electrophoresis of sgRNAs shows more than one band a. sgRNAs can form dimers. Always keep sgRNAson ice. A low amount of dimer will not affectthe function of sgRNA.b. DNA template is incompletely digested.Circular template can produce longertranscripts. Extend the incubation time and shake the digestion product occasionally. c. DNA template contamination. Add more TURBO DNase and extend incubation time.Cas9-D10A mRNA produces a smear on an agrose gel a. Use RNAsecure to inactivate RNase contaminationb. Use the recommended kits to improve thequality of the DNA template.(QIAGEN Mini-prepand PCR clean-up kits are recommended)Time Taken4 days for the construction of sgRNA expression vectors.1 day for the in vitro transcription and preparation of sgRNAs. 1 day for the in vitro transcription and preparation of Cas9-D10A mRNA.4 days for the superovulationb of females, collection of 1-cell embryos and microinjections1 week for the genotyping of founder animals.。

crispr-cas9基因敲除小鼠原理

CRISPR-CAS9基因敲除原理
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。

CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。

在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。

Cas9结合gRNA，gRNA 的长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA 上的约60个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9结合，并由此指导与DNA 的结合。

通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。

Cas9使用简单，可满足多个靶点同时操作。

Insertion
/deletion
HDR
gRNA
Cas9
Donor vector
基因敲除小鼠流程：。

CRISPRCas9基因敲除小鼠模型

CRISPRCas9基因敲除小鼠模型
根据基因序列设计合成sgRNA，针对Knockin插入点或点突变位置构建含Knockin片段或点突变的同源序列，与Cas9 mRNA共同注射到小鼠受精卵胞质，Cas9核酸酶、sgRNA、基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含Knockin的同源序列为模版修复基因组DNA，最终获得在目的DNA序列插入Knockin片段或点突变的Knockin小鼠。

根据基因序列设计合成两个sgRNA，分别针对两个Loxp的插入点，构建含Loxp的同源序列，与Cas9 mRNA共同注射到小鼠受精卵胞质，Cas9核糖酶、sgRNA、基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含Loxp同源序列为模板修复基因组DNA，最终获得在待敲除目的DNA序列两端各有一个Loxp序列的Flox小鼠。

利用CRISPRCas9技术构建纯合bmp9基因敲除C57BL6小鼠

利用CRISPR/Cas9技术构建纯合bmp9基因敲除C57BL/6小鼠
肝纤维化是一种由慢性肝脏损伤引起的病理变化,常见于酒精肝、脂肪肝及病毒性肝炎中。目前关于肝纤维化影响因子的报道有很多,但这些因子大多都与骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)的调控密切相关,BMP9或直接或以调控通路蛋白的形式间接参与肝脏组织进行Western Blotting和免疫组织化学验证,确定敲除动物种群建立成功。综上所述,本研究成功设计bmp9 sgRNA,体外转录并验证靶向于bmp9基因1号外显子sgRNA的敲除活性,建立起成熟的动物敲除模型制作体系。
对生产的后代小鼠从基因水平、蛋白水平和组织学水平进行鉴定,确定基因修饰后小鼠体内BMP9蛋白表达量降低甚至不表达, 对纯合小鼠扩群后的F3代小鼠肝脏组织进行Western Blotting 和免疫组织化学验证,结果表明品系建立成功。
BMP9是一种主要由肝脏表达分泌的生长分化因子,之前的研究大多集中于其参与干细胞分化及成骨形成过程,它在肝脏疾病尤其是慢性肝纤维化病程中的作用机制还鲜有报道。第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种方便快捷的基因操作工具,它的出现极大地方便了生物科学研究。
此技术只需针对靶序列进行sgRNA设计,科研人员就可以对几乎所有感兴趣的基因进行编辑和修饰,从而实现定点敲除或敲入。本研究通过胚胎显微注射bmp9 sgRNA和Cas9 mRNA的方法,成功建立纯合的bmp9基因敲除的C57BL/6小鼠,同时通过优化条件建立起成熟的基因敲除动物操作体系,为后期阐明BMP9参与调节肝纤维化的分子机制和具体的通路研究奠定基础,也为其它基因修饰动物模型的制作提供经验指导。
研究工作取得如下结果:1.CRISPR/Cas9基因敲除动物模型制作体系的建立根据NCBI和Ensemble数据库下载到的bmp9 cds序列信息,使用sgRNA在线设计评价平台设计并筛选出最佳的sgRNA序列,通过PCR和T7转录酶体外转录的方法获得纯化的bmp9 sgRNA, 将它与Cas9 mRNA混合后显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵细胞, 将成活的受精卵细胞回植到受体ICR母鼠体内待其生产。2.纯合 bmp9基因敲除小鼠的鉴定和扩群受体ICR小鼠生产后,提取后代小鼠基因组DNA测序进行基因型鉴定,选取F0代杂合敲除小鼠中确定发生移码突变的个体进行回交育种并挑选F2代中有表型变化且基因型鉴定为纯合敲除的小鼠进行Western Blotting验证。