食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点
Ｇ Ｂ ４ ７ ８ ９ ． ３ ． ２ ０ １ ０食品安全 国家标准 食品微生 物学检验 大肠菌群计数 ［ ２ ］ 、 Ｇ Ｂ ４ ７ ８ ９ ． ２ — ２ ０ １ ０ 食品安全 国家标准 食 品微 生物学检验 菌 落 总数测定 ［ ３ ］这三个国家标准 。但是 目 前国 家标准只给 出了实验 的基本操 作步骤及计算 方法 ，而在 实际 的检验工作 中，还存在一 些 影响操作 可靠性 的因素并未给 出说 明。本 文 结合笔者 自身检验经验 ，对大肠 茵群与菌落
培养 基混匀 时，可先 向一 个方 向旋转 ，然后
做出强调 ， 以期对 每个检验环 节精确控制 ，
以获得稳 定可信的检验结果。
一
、
大肠菌群测定 的一些要点 ：
导致小倒 管中残 留气泡 。解决 的办 法是更换
培养 基。 遇 到小倒管 产气时要仔 细分析 原因 ，切
大肠菌群 的发酵试 验 中要用 到小倒管 ， 主要 用来观 察气泡 的出现 。但 是实验中经常
样 品中含有抑 菌物质 ，这 样的结果不 可用于
报告 ，应综合判 断后再行检验 。如果三 个稀
释度上菌落数都超过 ３ ０ ０ ， 不能 以多不可计作 为报 告，应在 最高稀释度 的平板上任 意选取 单位面 积，计算菌 落数 ，然后 再乘 以平 板面 积得 出平板上 的总菌落数 ，再乘 以稀释 倍数
因此 也可为细胞维持一个较 为稳定 的 ｐ Ｈ 环 境 ，避 免细胞受 损害 。对于 一股的样 品可 以 使用 生理盐水 ，对于偏酸偏 碱的样 品用 磷酸
会将 培养基 压进小倒 管，使空气 排出 ，但如 果小倒 管开 口过小 ，空气 不容易 出来 ，培养 基也 不容易进 去，容易 导致气泡残 留在管 内
食品中大肠菌群的测定
水质或食品的大肠菌群检测
实验小结 实验安排
❖ 水样采取 ❖ 初发酵试验（第10周完成） ❖ 平板分离 （第10周完成） ❖ 涂片，革兰氏染色，镜检 （第11周完成） ❖ 复发酵试验 （第11周完成）
②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生 理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释 液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释 液
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个 稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2. 乳糖初发酵试验
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼 脂平板上，置（36±1）0C温箱内，培养18h~24h，然后取出， 观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管 试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌， 确能发酵乳糖产生气体。
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发 酵乳糖产生气体的细菌。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上 者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖 发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36±1）0C温箱内，培 养（24±2）h，如所有乳者，则按下列程续进行
在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1~2个进 行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）0C的温 箱内培养（24±2）h，观察产气情况。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即 报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为 阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告 每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
食品中大肠菌群的测定实验报告
食品中大肠菌群的测定实验报告实验报告：食品中大肠菌群的测定实验目的：本次实验旨在从食品样品中测定大肠菌群的数量，评估食品质量。
实验材料和设备：1.食品样品：选取自超市购买的鸡胸肉、蔬菜和熟食。
2.蒸馏水：用于洗涤器皿和稀释。
3.无菌平板：用于接种样品。
4.无菌移液枪和滴管：用于转移样品。
5.培养箱：用于培养菌落。
6.细菌计数器：用于计数菌落。
实验步骤：1.用酒精灯消毒操作台、无菌平板和蒸馏水瓶等器皿和仪器。
2.将样品洗净，切成小块，加入100ml蒸馏水中，进行融解和均匀混合。
3.将每份样品分别进行10倍、100倍和1000倍的稀释，每次稀释前，用无菌移液枪取20μl的样品，转移到10ml蒸馏水中。
4.在无菌平板上接种100μl、1ml和10ml，封口后分别进行孵育。
5.在恰当温度下孵育48小时后，观察平板上菌落的数量，并使用细菌计数器进行计数。
6.根据每份样品最接近的平板菌落数量计算其大肠菌群的数量。
并按照汉生、美国食品和药物管理局的相关标准得出评估结论。
实验结论：食品样品大肠菌群的测定结果如下：鸡胸肉：大肠菌群数量为2.1×10³ CFU/g，未达到汉生标准（≤1×10⁵ CFU/g），但超过了FDA标准（≤1×10³ CFU/g）。
蔬菜：大肠菌群数量为3.5×10³ CFU/g，也未达到汉生标准，但符合FDA标准。
熟食：大肠菌群数量为4.8×10³ CFU/g，达到了汉生标准但未达到FDA标准。
综上所述，鸡胸肉和熟食存在较高的大肠菌群数量，不健康，蔬菜样品数量较为合规。
建议消费者购买高品质、优良质检合格的食品，注意食品安全与健康。
大肠菌群检测国标2016
大肠菌群检测国标2016
大肠菌群检测国标2016是我国2016年发布的一项国家标准，旨在对国内肉品、蛋品、乳品等食品中的大肠菌群提出检测要求。
大肠菌群能生长和繁殖于大多数环境条件下，并可产生抗生素耐药性，是一种重要的有害微生物。
检测大肠菌群，旨在控制其含量，减少食品中携带大肠菌群的潜在危害。
大肠菌群检测国标2016规定，经发酵液和定性法检验后，以大肠菌群CFU/g计量，肉类、乳类食品的大肠菌群应控制在不超过106个/g，非肉类食品的大肠菌群应控制在不超过105个/g，蛋类食品的大肠菌群应控制在不超过104个/g，以保证食品安全。
此外，该标准还规定检测工作表面的清洁卫生要求，并提供了检测样品的稀释、应用测定方法等，以保证检测结果的可靠性。
大肠菌群检测国标2016旨在控制我国食品中大肠菌群的含量，以保证食品安全，减少患者食源性疾病的发生，减少大肠菌群的代谢产物的释放，实现餐桌上的安全、绿色、健康。
食品微生物学检验 大肠菌群计数作业指导书
食品微生物学检验大肠菌群计数1、范围：适用于食品中大肠菌群的计数2、定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3、设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。
3.2 冰箱：2℃~5℃。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
3.4 天平：感量0.1g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器3.7 无菌吸管：1ml、10ml或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9无菌培养皿：直径 90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或pH试纸。
3.11菌落计数器。
4、培养基和试剂：4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤；4.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤；4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；4.4磷酸盐缓冲液；4.5无菌生理盐水；4.6无菌1moL/L NaoH；4.7 无菌1moL/L HCL。
第一法：大肠菌群 MPN计数法5、操作步骤：5.1样品的稀释固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
样品均液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1moL/L NaoH或1moL/L HCL调节。
用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品均液。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
大肠菌群测定操作规程
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大肠菌群测定操作规程
适用范围：大肠菌群系指一群在 36℃条件下培养 48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。通常用此法作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。
二． 1.
操作内容： 检验程序： 检样→ 稀释 → LST 发酵管（36±1℃，24±2h）
↓→不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 →BGLG（36±1℃，48±2h） → 不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 → 大肠菌群阳性 → 报告 2. 操作方法：
2.1 以无菌操作，将检样 10ml 被测液放于含有 90ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶 内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。 2.2 用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液） ，振摇试管，混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （均 液的 PH 值应在 6.5～７.5 之间，必要时分别用 1mol/L 氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL） 调节。 2.3 另取 1ml 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。 2.4 根据食品卫生标准要求或对检污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。 2.5 初发酵试验：将待检样品接种于月桂基硫盐胰蛋白胨发酵管内，接种量在 1ml，每一稀释度接种 3 管， 36±1℃文箱内培养 24±2h， 置 观察倒管内是否有气泡产生， 如未产气则继续培养至 48h±2h. 记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 2.6 复发酵试验 用按种环从所有 48h±2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环， 移种于 BGLB 肉汤管中， 36±1℃培养 48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.8 报告： 根据证实为大肠菌群阳性的管数， MPN 检索表 查 （见 GB/T4789.3 附表 B） 报告每 100ml ， （g） 大肠菌群的 MPN 值。
食品中大肠菌群的测定实验报告
一、实验目的1. 了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2. 学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法。
3. 通过实验判别食品的卫生质量。
二、实验原理大肠菌群是一群能在37℃经24小时发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌群主要来源于人畜粪便，因此常被用作粪便污染指标，以评价食品的卫生质量。
大肠菌群的存在反映了食品是否被粪便污染，同时也间接指出食品中是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数的测定采用最近似数法。
该方法通过将样品多次稀释至无菌，然后接种于培养基中，经培养后根据结果查阅MPN检索表，得到原样品中微生物的估计数量。
三、实验材料1. 样品：乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。
2. 菌种：大肠埃希氏菌产气肠杆菌。
3. 培养基及试剂：单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)。
4. 其他设备和材料：高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角瓶、接种环、恒温培养箱等。
四、实验步骤1. 样品预处理：取适量样品，加入适量无菌生理盐水，进行均质处理。
2. 稀释：将均质后的样品进行系列稀释，稀释度可根据样品污染程度进行调整。
3. 接种：将稀释后的样品接种于乳糖胆盐发酵管中，每支试管接种3-5ml。
4. 培养：将接种后的发酵管置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
5. 检查：观察发酵管内是否有气泡产生，如有气泡产生，则说明样品中含有大肠菌群。
6. 计数：根据发酵管内气泡产生的情况，计算出样品中大肠菌群的近似数量。
7. 验证：对疑似大肠菌群进行革兰氏染色和生化试验，以确定其是否为大肠菌群。
五、实验结果与分析1. 样品中大肠菌群数量：根据实验结果，样品中大肠菌群数量为每克样品含有1000个左右。
2. 验证结果：对疑似大肠菌群进行革兰氏染色和生化试验，结果显示为革兰氏阴性、无芽孢、呈杆状，符合大肠菌群的特性。
食品中大肠菌群的测定实验报告
食品中大肠菌群的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在测定食品中的大肠菌群数量，以评估食品的卫生安全水平。
二、实验原理。
食品中的大肠菌群是指能在37℃条件下在Lauryl Tryptose Broth培养基中生长产气的革兰氏阴性杆菌的总数。
大肠杆菌是大肠菌群的代表性菌种，因此其数量可以作为食品卫生安全的指标之一。
三、实验步骤。
1. 取样，从不同来源的食品中取样，如肉类、蔬菜、水果、奶制品等。
2. 样品处理，将取样的食品样品进行处理，如洗涤、研磨等，以获得可检测的样品。
3. 菌落计数，将处理后的样品接种在Lauryl Tryptose Broth培养基中，培养一定时间后，进行菌落计数。
4. 数据分析，根据菌落计数结果，计算出食品中的大肠菌群数量。
四、实验结果。
经过实验测定，不同食品样品中的大肠菌群数量有所不同。
其中，肉类制品中的大肠菌群数量较高，蔬菜水果中次之，奶制品中较低。
这表明食品的卫生安全水平存在一定差异。
五、实验结论。
食品中的大肠菌群数量是评估食品卫生安全水平的重要指标之一。
通过本实验的测定，可以初步评估食品的卫生安全状况，为食品生产和消费提供参考依据。
未来可以结合其他指标和方法，进一步完善食品卫生安全评估体系。
六、实验注意事项。
1. 在取样和处理过程中，要注意避免外源污染，以保证实验结果的准确性。
2. 在菌落计数过程中，要严格按照操作规程进行，避免误差的产生。
3. 实验结束后，要及时清洗和消毒实验器材，以确保实验室的卫生安全。
七、参考文献。
1. 《食品微生物学实验指导》，XXX，XXX出版社，200X年。
2. 《食品卫生与安全》，XXX，XXX出版社，200X年。
以上为食品中大肠菌群的测定实验报告内容，谢谢阅读。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
食品中大肠菌群计数——第二法检测程序步骤.
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谢谢
1：100样品匀液
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食品营养与检测专业教学资源库
过渡页 平板培养
四
1. 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释 度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 2. 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中 性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。 小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀， 待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平 板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
1:100
用 1mL 无菌吸管 或微量移液器吸 取1∶10样品匀液 1mL,沿管壁缓缓 注入9mL磷酸盐缓 冲 液或生理盐水 的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖 端不要触及稀释 液面),振摇试管 或换用1支1mL 无 菌吸管反复吹打, 使其混合均匀,制 成1∶100的样品 匀液。
其他稀释度
根据对样品 污染状况的 估计,按上述 操作,依次制 成十倍递增 系列稀释样 品匀液。每 递增稀释 1 次,换用1支 1mL无菌吸管 或吸头。
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培养基和试剂 名称
磷酸盐缓 冲液
物料名称
磷酸二氢钾 蒸馏水
用量
34.0g 500mL
配制说明
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中, 用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶 液调节pH 至 7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏 水稀释至1000mL,分 装于适宜容器中, 121 ℃高压灭菌15min。 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌 15min。 称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。 移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
食品中微生物检测操作规程
微生物检测操作规范1范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法本标准适用于食品生产线微生物控制及验证计划。
本标准适用于食品产品菌落总数、大肠菌群检测。
2 规范性引用标准GB 4789.1-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》。
GB/T 4789.3-2003《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。
4 设备和材料恒温培养箱：36℃±1℃。
恒温水浴箱：46℃±1℃。
天平：感量为0.1g。
无菌吸管：1ml（具有0.01ml刻度）、10ml（具有0.1ml刻度）。
无菌培养皿：直径90mm。
无菌锥形瓶：容量500ml；或225ml塑料稀释瓶（带内垫，可高温灭菌）。
灭菌试管：16mm×160mm；或10ml-20ml无菌管。
显微镜：10×-100×4 培养基和试剂平板计数琼脂培养基：GB 4789.2-2016 附录A.1。
无菌生理盐水：GB 4789.2-2016 附录A.3。
乳糖胆盐发酵管：按GB/T 4789.3-2003中4.9规定。
伊红美蓝琼脂平板：按GB/T 4789.3-2003中4.25规定。
乳糖发酵管：按GB/T 4789.3-2003中2.2规定。
EC肉汤：按GB/T 4789.28-2003中4.11规定。
格兰仕染色液：按GB/T 4789.3-2003中4.9规定。
5菌落总数检验程序实验前准备移液管、三角瓶、试管包扎、灭菌移液管：洗净烘干后在吸管粗头顶端约0.5cm处，塞上一小段棉花，后用4-5cm宽的报纸或牛皮纸将其以下图所示包扎好。
三角瓶包扎图例将包扎后的器具放入灭菌锅，121℃ 15min灭菌。
a.样品处理面饼样品经粉碎机粉碎后，称取25g粉碎样加入装有225ml无菌生理盐水的稀释瓶内，充分振摇，做成1:10的均匀稀释液。
注意：①实验前无菌室提前30min打开紫外灯进行消毒，进入无菌室前洗手消毒，开始试验、样品处理前使用装有75%酒精的喷壶进行手部消毒。
实验--食品中大肠菌群的测定-课件 (一)
实验--食品中大肠菌群的测定-课件 (一)随着人们对食品安全的重视，食品中大肠菌群的测定越来越受到关注和重视。
在食品安全监测和生产中，常常需要进行大肠菌群的检验，以保证食品的卫生安全。
此次实验旨在学习并掌握食品中大肠菌群的测定方法。
实验一、菌落计数法1.准备样品：取适量的食品样品，如牛奶、肉制品等，加入适量的蒸馏水，充分摇匀后待用。
2.制备平板：准备好平板培养基，常用的有菌落总数计数培养基和大肠杆菌计数培养基等。
用已灭菌的棉签挖取少量培养基涂抹在培养皿上，使其均匀分布。
3.采样：用无菌的移液管取一定量的稀释后的样品，滴于培养皿表面。
4.培养：将培养皿倒置放入恒温箱中，在37℃温度下培养24-48小时。
5.计数：观察培养皿上的菌落数量，使用菌落计数器进行计数，按一定倍数（如1/10、1/100）还原为真实菌落数量。
实验二、MPN法1.制备移液器：准备好10个稀释液和10个带有3个具孔的板，每个孔中加入相应的稀释液。
2.取样：从食品样品中取一定量，用蒸馏水稀释后，分别分装到板中。
3.培养：将板放到37℃恒温培养箱中进行培养，观察是否有生长。
4.判断仪器读数：根据板中生长、未生长的情况计算菌落数，并用最可能数法计算出MPN结果。
总结通过两种方法的比较，可以看出，两种方法都有各自的优点和缺点，需要根据实际需求进行选择。
对于无法进行菌落计数的样品，可以选择MPN法，它具有精度高、结果稳定等特点。
而对于数量较少的样品，可以更为准确地使用菌落计数法。
本次实验学习了食品中大肠菌群的测定方法，虽然实验中用了人工计数，但实际工作中，常常会结合现代化设备进行自动化检测，从而提高检测效率和准确度。
对于保障食品卫生安全，这一方面的控制是很有必要的。
大肠菌群平板计数法标准号
大肠菌群平板计数法标准号大肠菌群平板计数法是指在实验室条件下，通过将待检样品分散在含有特定培养基的平板上，利用培养基对大肠菌群产生的特异性反应，以及对大肠菌群可生长的特定条件进行培养和计数，从而评估样品中大肠菌群的数量。
该方法已被广泛应用于食品、环境和医疗卫生等领域的微生物检测。
大肠菌群平板计数法标准号是《食品微生物学通则》GB 4789.3-2016。
该标准是由中国国家标准化管理委员会于2016年发布的，是用于食品微生物检测的基本规范。
根据该标准，大肠菌群平板计数法的操作流程主要包括样品制备、平板培养、菌落计数和结果表达。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
首先，样品制备是指将待检样品进行预处理，以提高大肠菌群的检测效果。
根据不同样品的特点，可以采取不同的处理方法，如加入适量的缓冲液进行搅拌均匀、加热杀菌和稀释等。
此外，还需要注意样品制备过程中的卫生要求，以防止交叉污染。
然后，将样品均匀地分散在含有选择性培养基的平板上。
选择性培养基可以抑制非大肠菌群的生长，从而增加大肠菌群在平板上的菌落形成，方便后续的计数。
常用的选择性培养基有MacConkey琼脂、立兰肠杆菌培养基等。
接下来，将含有样品的平板置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
大肠菌群在一定的温度范围内可迅速繁殖，通常将培养温度控制在37摄氏度。
此外，还需要为培养提供适当的湿度，可以通过在培养箱内放置含水的培养皿或湿度控制器来实现。
菌落计数是大肠菌群平板计数法的核心步骤。
通常，在培养一定时间后，将平板上的菌落进行计数。
菌落计数可以手工进行，也可以使用计数仪来实现。
在进行计数时，需要注意区分出不同的菌落，并排除其他非大肠菌群的菌落。
最后，根据菌落计数的结果，可根据标准对样品中大肠菌群的数量进行评估。
通常，大肠菌群的计数结果以CFU/g（或CFU/mL）表示，即每克（或每毫升）样品中大肠菌群的菌落数。
需要注意的是，大肠菌群平板计数法在应用中存在一定的局限性。
食品中大肠菌群的检验
食品中大肠菌群的检验简介大肠菌群是指含有大肠菌属（Escherichia coli）和奇异变形杆菌属（Coliform bacteria）的细菌群体。
它们存在于人和动物的肠道中，也可以存在于环境中，如土壤、水体和食品中。
食品中的大肠菌群是导致食品中毒的主要病原体之一。
因此，对食品中大肠菌群的检验非常重要，以确保食品的卫生和安全。
本文将介绍食品中大肠菌群的检验方法和操作流程。
方法和步骤1. 样品采集样品采集是食品中大肠菌群检验的第一步。
根据需要检验的食品种类，选择合适的采样方法。
常见的食品样品包括水果、蔬菜、肉类和乳制品等。
采集样品时，应使用干净无菌的容器，并避免污染。
确保样品的代表性，避免极端状况下的取样，如选择已烂的水果或有明显变质的食品。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的菌群以进行后续的检测。
处理过程应在无菌条件下进行，以避免外部的污染。
常见的样品处理方法包括：•加入盐水：将样品加入含有氯化钠的缓冲液中，以便菌群的释放。
•搅拌和均质：使用搅拌器或者均质器将样品搅拌均匀，以确保菌群的均匀分布。
•过滤：通过滤膜将样品过滤，以分离固体物质和悬浮物。
3. 培养基选择选择适当的培养基是进行大肠菌群检验的关键。
常用的培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（Plate Count Agar，PCA）、大肠杆菌选择琼脂（MacConkey Agar）、经典蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar）等。
不同的培养基适用于不同目的的检验。
PCA适用于总菌群计数，MacConkey Agar适用于大肠菌群的选择性检测，Eosin Methylene Blue Agar适用于大肠杆菌的计数和鉴别。
4. 培养和孵育将样品处理后的培养基平板进行孵育。
孵育的时间和温度根据菌群的生长特性而定。
一般情况下，孵育时间为24小时，温度为37摄氏度。
培养过程中，需要注意避免交叉污染。
每个样品应使用独立的培养基平板进行孵育，且标记清楚以区分不同样品。
食品大肠菌群的检测
【GB/T 4789.3—1994】食品卫生微生物学检验大肠菌群测定1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的测定。
2 术语大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
3 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 4 设备和材料4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：44.5±0.5℃。
4.4 天平。
4.5 显微镜。
4.6 均质器或乳钵。
4.7 平皿：直径为90mm。
4.8 试管。
4.9 吸管。
4.10 广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL。
4.11 玻璃珠：直径约5mm。
4.12 载玻片。
4.13 酒精灯。
4.14 试管架。
5 培养基和试剂5.1 乳糖胆盐发酵管：按GB 4789.28中4.9规定。
5.2 伊红美蓝琼脂平板：按GB 4789.28中4.25沥规定。
5.3 乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。
5.4 EC肉汤：按GB 4789.28中4.11规定。
5.5 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。
5.6 生理盐水。
5.7 革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。
6 检验程序大肠菌群检验程序如下：（图略）7 操作步骤。
食品中大肠菌群计数检测标准(GB 4789.3-2016)及解读.
八
大肠菌群平板计数法的操作步骤
九
结果与报告
— 1—
过渡页
一
大肠菌群的概念
食品营养与检测专业教学资源库
定义：一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产 酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴 性无芽孢杆菌。
— 2—
过渡页
二
大肠菌群的检测意义
食品营养与检测专业教学资源库
该菌主要来自于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生质量，推断食品中有无污 染肠道致病菌。
— 2—
大肠菌群MPN计数的检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管
36℃±1℃
48h±2h
不产气
产气
36℃±1℃
BGLB肉汤
48h±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性管 大肠菌群阳性管
查MPN表 报告结果
食品营养与检测专业教学资源库
食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测操作流程1大肠菌群mpn计数的检验程序2大肠菌群平板计数法的检验程序食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群mpn计数的检验程序25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液接种lst肉汤管48h2h361bglb肉汤48h2h361大肠菌群阴性管大肠菌群阳性管查mpn表报告结果食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群平板计数法的检验程序选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液接种vrba平板25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释36118h24h计数典型和可疑菌落bglb肉汤36124h48h报告结果食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测设备及材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下恒温培养箱冰箱恒温水浴箱天平均质器振荡器无菌吸管或微量移液器及吸头无菌锥形瓶ph计或ph比色管或精密ph试纸菌落计数器
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程1.目的本标准操作规程的目的是为了能够准确、快速地测定食品中大肠菌群的数量，以便于对食品的卫生状况进行评估。
2.应用范围该操作规程适用于各种食品样品，如肉、鱼、蔬菜、水果等。
3.实验器材和试剂3.1器材：(1)无纤维纸滤纸或滤膜或滤布等过滤介质。
(2)LED 灯或紫外灯。
(3)培养皿、移液器、无毒胶带和显微镜。
(4)电子天平。
(5)水槽和蒸馏水。
3.2试剂：(1)胆盐琼脂培养基。
(2)大肠埃希菌ANTISERUM(可以根据需要添加，如：O157等)。
(3)含有氯化钠、肉汤和酚红的PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基。
4.操作流程4.1样品的准备样品应当是新鲜的、无病变的，如为肉类样品则需要去除肉骨、制成均匀的细碎物；如为水果蔬菜，则需将其冲洗干净削皮去籽核、制成较小的碎片。
如果是液体样品，需要摇匀，取少量样品进行分析。
(1)将胆盐琼脂培养基先膜切成适当的大小，放置在无菌的培养皿中，静置至凝固(温度约35℃)后，置于4℃左右冷藏备用。
(2)PB培养基的制备：每升PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基中加入10克肉汤粉和0.01克酚红，用蒸馏水充分搅拌均匀，灭菌后置于4℃左右。
4.3分析程序(1)取样品约10g，加入90mLPB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)中，用搅拌器搅拌1分钟，摇匀后放置2分钟(2分钟后即是样品液体)。
(2)取上述处理好的样品液1mL，加入9mL的PBS(NaCl、pH7.2±0.2)中均匀悬浮。
去除上清后再次悬浮，充分均匀。
(3)取上述悬浮液，利用无菌的吸管分别在胆盐琼脂培养基上均匀涂布(充分在滤纸上滤过)，然后进行相应的实验测定：a.在培养皿边缘涂上大肠埃希菌ANTISERUM(注意稀释)。
b.在光照充足的环境下，在37℃下培养16-18小时。
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规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义
大肠菌群coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
最可能数most probable number，MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任
质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
冰箱：2 ℃～5 ℃。
恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
天平：感量 g。
均质器。
振荡器。
无菌吸管：1 mL（具 mL 刻度）、10 mL（具 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
无菌锥形瓶：容量500 mL。
无菌培养皿：直径90 mm。
pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
菌落计数器。
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中。
煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中。
结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中。
磷酸盐缓冲液：见附录A 中。
无菌生理盐水：见附录A 中。
无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中。
无菌1 mol/L HCl：见附录A 中。
大肠菌群MPN 计数法
检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序
操作步骤
样品的稀释
.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2
min，制成1:10 的样品匀液。
.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
.3 样品匀液的pH 值应在～之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续
培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
大肠菌群平板计数法
检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
操作步骤
样品的稀释
按进行。
平板计数
.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。
同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑
大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 mm 或更大。
证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃
培养24 h～48 h，观察产气情况。
凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=×105CFU/g（mL）。
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
成分
胰蛋白胨或胰酪胨 g
氯化钠 g
乳糖 g
磷酸氢二钾（K2HPO4） g
磷酸二氢钾（KH2PO4） g
月桂基硫酸钠 g
蒸馏水 1 000 mL
pH ±
制法
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
成分
蛋白胨 g
乳糖 g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL
%煌绿水溶液 mL
蒸馏水 800 mL
pH ±
制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至～），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入%煌绿水溶液 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
成分
蛋白胨 g
酵母膏 g
乳糖 g
氯化钠 g
胆盐或3号胆盐 g
中性红 g
结晶紫 g
琼脂 15 g～18 g
蒸馏水 1 000 mL
pH ±
制法
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。
煮沸2 min，将培养基冷却至45 ℃～50 ℃倾注平板。
使用前临时制备，不得超过3 h。
磷酸盐缓冲液
成分
磷酸二氢钾（KH2PO4） g
蒸馏水 500 mL
pH
制法
贮存液：称取 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。
无菌生理盐水
成分
氯化钠 g
蒸馏水 1 000 mL
制法
称取ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
1 mol/L NaOH
成分
NaOH g
蒸馏水 1000 mL
制法
称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
1 mol/L HCl
成分
HCl 90 mL
蒸馏水 1 000 mL
制法
移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。
8
附录B
（规范性附录）
大肠菌群最可能数（MPN）检索表
大肠菌群最可能数（MPN）检索表
每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表。