酶分子修饰和改造课件
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饰剂。 • ．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行
修饰。
7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
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三、小分子修饰剂的作用
碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲
酸（ＤＴＮＢ）。
• DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。
2．氨基的化学修饰
• Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。 • 常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸
（TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中
三、酶化学修饰的基本原理
1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性
• 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易 伸展打开，从而增强酶的热稳定性。
2．保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电 斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护 酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑 制剂能力增强。
Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯
(DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
3. 羧基的化学修饰
• 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 • 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。 • 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测
定羧基含量。 • ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 • ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修
提高医用酶稳定性 延长医用酶体内半衰期
• 生物技术领域 改变酶最适pH
改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或 mRNA 进行改造或修饰
2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的 一级结构进行改造
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等
发生改变。
（一）叠氮法
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 • 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性
2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性
乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应
• 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、 苯甲酰卤代物等。
• 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。
3．氧化和还原反应
• 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原 剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等）
三、酶化学修饰的基本原理
3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分
子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 • 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭
受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。
4. 消除酶的抗原性 • 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了
（四）羰二亚胺法
• 修饰酶分子上的羧基。
3.2 糖类的修饰反应
（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应
• 具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质 等。
• 修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二 醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
三、举例
3.1 聚乙二醇及其修饰反应
• 聚乙二醇的特点：
①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
一、概念 • 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发
生某些精细的改变，从而改变酶的特性
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
• 糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、Sephadex G25）
• 聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸 、丙烯酸等的单聚或共聚物）
等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间
七、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟
• 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二 硫键（还原）。
4．芳香环取代反应
• 修饰剂：四硝基甲烷 • 修饰残基：Tyr，Phe。
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰
• 巯基是许多酶活性中心的催化基团 • 形成二硫键稳定酶的结构 • 最容易反应的侧键基团之一 • 通过修饰可提高酶的稳定性 • 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和
第一节 酶化学修饰的原理和方法
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。
酶化学修饰的应用
• 理论研究 酶中特定基团之间的距离
氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定
• 医药 解除医用酶免疫源性和抗原性
修饰。
7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
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三、小分子修饰剂的作用
碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲
酸（ＤＴＮＢ）。
• DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。
2．氨基的化学修饰
• Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。 • 常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸
（TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中
三、酶化学修饰的基本原理
1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性
• 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易 伸展打开，从而增强酶的热稳定性。
2．保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电 斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护 酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑 制剂能力增强。
Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯
(DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
3. 羧基的化学修饰
• 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 • 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。 • 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测
定羧基含量。 • ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 • ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修
提高医用酶稳定性 延长医用酶体内半衰期
• 生物技术领域 改变酶最适pH
改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或 mRNA 进行改造或修饰
2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的 一级结构进行改造
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等
发生改变。
（一）叠氮法
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 • 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性
2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性
乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应
• 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、 苯甲酰卤代物等。
• 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。
3．氧化和还原反应
• 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原 剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等）
三、酶化学修饰的基本原理
3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分
子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 • 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭
受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。
4. 消除酶的抗原性 • 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了
（四）羰二亚胺法
• 修饰酶分子上的羧基。
3.2 糖类的修饰反应
（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应
• 具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质 等。
• 修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二 醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
三、举例
3.1 聚乙二醇及其修饰反应
• 聚乙二醇的特点：
①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
一、概念 • 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发
生某些精细的改变，从而改变酶的特性
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
• 糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、Sephadex G25）
• 聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸 、丙烯酸等的单聚或共聚物）
等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间
七、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟
• 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二 硫键（还原）。
4．芳香环取代反应
• 修饰剂：四硝基甲烷 • 修饰残基：Tyr，Phe。
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰
• 巯基是许多酶活性中心的催化基团 • 形成二硫键稳定酶的结构 • 最容易反应的侧键基团之一 • 通过修饰可提高酶的稳定性 • 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和
第一节 酶化学修饰的原理和方法
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。
酶化学修饰的应用
• 理论研究 酶中特定基团之间的距离
氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定
• 医药 解除医用酶免疫源性和抗原性