8蔗糖酶Km值测定
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3、葡萄糖标准曲线的制备。
酶活力预试
1
2（对照）
0.3M蔗糖溶液ml
0.60
0.60
H2O
1.1
1.1
pH5.0醋酸缓冲液ml
0.2
0.2
25℃水浴中保温3min
稀释后的蔗糖酶溶液ml
0.1
0
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200;
）
25℃水浴5min
二硝基水杨酸试剂
2
2
稀释后的蔗糖酶溶液ml
思考题
• Km值的含义及测定的方法。
一、蔗糖酶的溶解
• 酶粉溶于1 ml蒸馏水，10000 rpm室温离心 5分钟后去掉不溶物，此时即为酶原液。
二、蔗糖酶稀释以及活力测定
1、将酶原液按照一定比例稀释，建议1:10，1:20， 1:50和1:100。不同稀释倍数的酶液各准备2 ml。
2、稀释后酶液的活力测定。
为什么要将酶液进行稀释？ 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定？
v =[葡萄糖产量•10]
1ml酶在单位时间(5min)内的葡萄 糖产量 (mg)
[S]=0.3V/2
(mol/L)
1/[S]
1/v
6
7
v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]=0.3V/2 ： [S]代表底物蔗糖的摩尔浓度；V代表每只试管中加入的底物蔗糖的 体积（ml）；2指的是反应的总体积是2ml；0.3为底物蔗糖的浓度。
4. 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本 内容之一。
原理 米氏方程和双倒数作图法
酶反应速度与底物浓度之间的定量关系
[S]表示底物浓度 Vmax表示最大酶促反应速度
Lineeraver-Burk（林-贝氏作图法）
实验步骤
一、蔗糖酶溶解 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 三、底物对反应速度的影响（Km测定）
实验八 蔗糖酶Km值测定
原理 底物浓度对酶活性的影响
1. 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。
2. Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所 对应的底物浓度。
3. 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值 也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。
以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。
底物浓度与酶促反应速度
管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
0.3 M蔗糖溶液ml
0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.40
0.60
H2O
1.66 1.64 1.62 1.60 1.50 1.30
1.10
pH5.0醋酸缓冲液，ml
0.2
0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1mol/L醋酸缓冲液
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
pH5.0
ml
H2O ml
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
二硝基水杨酸溶液ml
2
2
2
2
2
2
加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮5 min，取出 用自来水冷却3min，加入9 ml蒸馏水，混匀后以零号管调零，于 520nm处测定光密度。
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
25℃预热3分钟
加入0.1ml稀释合适倍数的酶液
25℃准确反应5 min，迅速加入2 ml二硝基水杨酸溶液 混匀，沸水浴5min，自来水冷却3min，加入9ml蒸馏水，以对照管调“0”，520nm测OD值。
每只试管均要做自身对照
结果处理
管号 结果
12
3
4
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5
OD520
葡萄糖产量，mg
0
0.1
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200）
沸水浴煮5min
取出后经自来水冷却3 min，加入9 ml蒸馏水，以对照管调零点，
于520nm处测光密度值。 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值。
为什么？
葡萄糖标准曲线的制备
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
1mg/ml标准葡萄糖溶液 0 ml
酶活力预试
1
2（对照）
0.3M蔗糖溶液ml
0.60
0.60
H2O
1.1
1.1
pH5.0醋酸缓冲液ml
0.2
0.2
25℃水浴中保温3min
稀释后的蔗糖酶溶液ml
0.1
0
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200;
）
25℃水浴5min
二硝基水杨酸试剂
2
2
稀释后的蔗糖酶溶液ml
思考题
• Km值的含义及测定的方法。
一、蔗糖酶的溶解
• 酶粉溶于1 ml蒸馏水，10000 rpm室温离心 5分钟后去掉不溶物，此时即为酶原液。
二、蔗糖酶稀释以及活力测定
1、将酶原液按照一定比例稀释，建议1:10，1:20， 1:50和1:100。不同稀释倍数的酶液各准备2 ml。
2、稀释后酶液的活力测定。
为什么要将酶液进行稀释？ 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定？
v =[葡萄糖产量•10]
1ml酶在单位时间(5min)内的葡萄 糖产量 (mg)
[S]=0.3V/2
(mol/L)
1/[S]
1/v
6
7
v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]=0.3V/2 ： [S]代表底物蔗糖的摩尔浓度；V代表每只试管中加入的底物蔗糖的 体积（ml）；2指的是反应的总体积是2ml；0.3为底物蔗糖的浓度。
4. 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本 内容之一。
原理 米氏方程和双倒数作图法
酶反应速度与底物浓度之间的定量关系
[S]表示底物浓度 Vmax表示最大酶促反应速度
Lineeraver-Burk（林-贝氏作图法）
实验步骤
一、蔗糖酶溶解 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 三、底物对反应速度的影响（Km测定）
实验八 蔗糖酶Km值测定
原理 底物浓度对酶活性的影响
1. 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。
2. Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所 对应的底物浓度。
3. 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值 也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。
以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。
底物浓度与酶促反应速度
管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
0.3 M蔗糖溶液ml
0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.40
0.60
H2O
1.66 1.64 1.62 1.60 1.50 1.30
1.10
pH5.0醋酸缓冲液，ml
0.2
0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1mol/L醋酸缓冲液
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
pH5.0
ml
H2O ml
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
二硝基水杨酸溶液ml
2
2
2
2
2
2
加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮5 min，取出 用自来水冷却3min，加入9 ml蒸馏水，混匀后以零号管调零，于 520nm处测定光密度。
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
25℃预热3分钟
加入0.1ml稀释合适倍数的酶液
25℃准确反应5 min，迅速加入2 ml二硝基水杨酸溶液 混匀，沸水浴5min，自来水冷却3min，加入9ml蒸馏水，以对照管调“0”，520nm测OD值。
每只试管均要做自身对照
结果处理
管号 结果
12
3
4
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5
OD520
葡萄糖产量，mg
0
0.1
（1:20; 1:50; 1:100; 1:200）
沸水浴煮5min
取出后经自来水冷却3 min，加入9 ml蒸馏水，以对照管调零点，
于520nm处测光密度值。 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值。
为什么？
葡萄糖标准曲线的制备
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
1mg/ml标准葡萄糖溶液 0 ml