实验二愈伤组织的诱导与分化
(2021年整理)第三章-愈伤组织诱导
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第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage， Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下,经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛,合成加强,为分裂做准备.持续十几小时～几天。
2）分裂期（divition stage/phase)：外植体切口边缘膨大,外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期(formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地:松脆易碎的颗粒状;紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色;淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般,淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
实验2-3 胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
（2）植物材料的表面灭菌和接种
①操作人员洗手消毒
②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒， 取出用无菌水冲洗干净。 ④倒入消毒剂（ 0.1%HgCl2 ）并计时
⑤到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并 用无菌水清洗干净。
⑥将材料切块后接种到诱导培养基上。
6 实验流程
（1）准备工作
① 外植体表面灭菌前的准备工作 a 接种室的清洁和消毒； b 超净工作台的开机和消毒；
c 消毒溶液、无菌水、装等的准备。
② 实验材料的准备
a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验 材料；
b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水 冲净。
（2）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制
配方：MS基本培养基＋ 2mg/L NAA＋ 0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋ 0.7 ％琼脂＋3％蔗糖 配制流程：同胡萝卜愈伤组织诱导培养基 的配制
作业
详细写出胡萝卜愈伤组织诱导培养的操作 步骤。
实验2-2 胡萝卜愈伤组织的诱导
1 实验目的
通过本次实验，使同学能够熟练掌握外植 体的表面消毒技术和无菌操作技术。 2 实验原理 将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒 后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基 上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。
3 主要实验用具和仪器
用具：酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、 枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养 皿、酒精灯等。 仪器：超净工作台、恒温培养箱 4 药品和试剂 胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75 ％酒精、0.1%HgCl2。 5 实验材料：胡萝卜肉质直根
2 烟草愈伤组织诱导实验
烟草叶片愈伤组织诱导分化实验1. 实验目的（1）通过诱导植物（烟草叶片、水稻种子）愈伤组织和器官发生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用。
（2）了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点。
2. 实验原理外植体形成愈伤组织大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。
启动期主要通过激素以及环境因素的诱导使外植体细胞代谢增强，大量蛋白质与核酸形成为细胞分裂做准备；分裂期时外植体细胞在激素诱导下脱分化并不断增殖，形成结构疏松的组织块；形成期时，由于不同植物生长激素的诱导使愈伤组织形成根、芽等形态分化。
烟草为常见模式植物之一，常用于植物组织培养，是研究细胞脱分化和再分化的理想材料。
在愈伤组织诱导及分化过程中，光照条件起到的作用是促使愈伤组织进行光合作用生成糖类，促使代谢活动进行。
6-BA、NAA均为植物生长调节剂，6-BA属于细胞分裂素，可诱导愈伤组织发生并促进牙的形成；NAA属于细胞分裂素，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。
根据Skoog和Miller提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器管分化的概念，相对高的生长素有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定芽的分化。
通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物中也得到了证实。
3. 实验材料与操作方法3.1 实验材料3.1.1 材料选择：烟草By-2，滤纸片，枪头3.1.2 实验试剂：（1）植物生长调节剂（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）6-BA 0.5mg/mL（1mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）NAA 0.5mg/mL（1 mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）（2）抗生素（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）卡那霉素50 mg/mL（蒸馏水定容）利福平15 mg/mL（无水乙醇溶解再用蒸馏水定容）链霉素30 mg/mL（蒸馏水定容）羧苄青霉素100 mg/mL（蒸馏水定容）（3）实验用培养基MS大量元素储存母液（50×，蒸馏水定容）：1650mg/L NH4NO3+1900mg/L KNO3+370mg/L MgSO4·7H2O+170mg/L KH2PO4+440mg/LCaCl2·2H2O（CaCl2·2H2O在配制过程中不易溶解，可单独配成储液存放）MS微量元素储存母液（100×，蒸馏水定容）：0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+22.3mg/L MnSO4·4H2O+8.6mg/L ZnSO4·7H2O+ 0.25mg/L Na2MoO4·2H2O+0.025mg/L CuSO4·5H2O+0.025mg/L CoCl2·6H2O +27.8mg/LFeSO4·7H2O +37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA·2H2O两个试剂配制成100×溶液4℃冰箱避光储存）MS有机成分储存母液（100×，蒸馏水定容）：3mg/L甘氨酸+0.5mg/L烟酸（维生素B5）+0.5mg/L盐酸吡哆醇（维生素B6）+0.1mg/L盐酸硫胺素（维生素B1）+100mg/L肌醇（肌醇难溶解，一般独自配成浓缩液储存）MS培养基（NaOH调节至pH 5.8，蒸馏水定容）：1×大量元素+1×微量元素+1×有机成分+30g/L蔗糖+0.8%琼脂+不同比例生长素（6-BA+IAA）3.1.3 实验仪器：超净工作台，烧杯，锥形瓶，培养皿，枪形镊子，眼科剪，移液枪，酒精灯，光照培养室，3.2 操作方法取幼嫩烟草叶片约5片（选择幼年的外植体较好，如分生组织、维管束、形成层组织、静止的薄壁组织），用自来水清洗晾干。
愈伤组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术的基本操作流程。
2. 熟悉愈伤组织的诱导方法及再分化过程。
3. 学习植物激素在愈伤组织形成与再分化中的作用。
4. 了解植物细胞的全能性及组织培养技术在植物育种中的应用。
二、实验原理植物组织培养技术是将植物器官、组织或细胞在人工条件下进行无菌培养，使其在适宜的培养环境中生长、分化，最终形成完整植株的过程。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一个重要阶段，它是由已经分化的细胞脱分化形成的无定形细胞团。
通过诱导愈伤组织，可以进一步分化为根、茎、叶等器官，实现植物繁殖和育种。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段。
2. 试剂：无菌水、无菌滤纸、70%乙醇、5%次氯酸钠、琼脂、蔗糖、硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、生长素、细胞分裂素、琼脂酶、滤纸等。
四、实验步骤1. 材料预处理（1）将水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段分别用70%乙醇消毒30秒，再用5%次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的材料用无菌滤纸吸干水分。
2. 愈伤组织诱导（1）将预处理后的材料切成约1cm×1cm的小块，放入含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度和光照条件下培养。
3. 愈伤组织再分化（1）将愈伤组织转移到含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）在适宜的温度和光照条件下培养，观察愈伤组织分化为根、茎、叶等器官的情况。
4. 数据记录与分析（1）观察并记录愈伤组织的生长情况，包括生长速度、愈伤组织颜色、形态等。
（2）观察并记录愈伤组织再分化为根、茎、叶等器官的情况，包括器官形态、生长速度等。
（3）分析不同植物激素浓度对愈伤组织形成与再分化的影响。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导实验结果表明，水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段在含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中均能诱导出愈伤组织。
实验二 植物组织培养2-愈伤组织的诱导
中国海洋大学实验报告2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理；2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程；3、熟悉超净工作台的使用。
二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。
三、实验仪器试剂1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水四、实验步骤：（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。
（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。
实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化一、目的掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；四、仪器设备及用具（一） 仪器设备超净工作台 培养室（二） 用具（每组5人用量）量筒：100ml ×2培养皿：￠9cm ×1三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1枪形镊：×4无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5五、试剂及培养基（一） 试剂75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml)(二) 培养基1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l六、实验步骤1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制（1）、75%酒精：每组配95ml 。
量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可.（2）、2%NaCLO ：每组配100ml.x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数；y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。
3、种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。
每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 yX= (ml)分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案
烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案班第组一、实验目的：诱导烟草叶片长出愈伤组织（或根或者芽）二、实验用具：超净工作台、镊子、手术剪、酒精灯、培养皿、广口瓶、高压灭菌锅等。
三、实验材料与试剂1．实验材料烟草叶片2．试剂 MS培养基、75%酒精、0.1%升汞、无菌水、IAA(0.1mg/mL)、6BA( 0.1mg/mL)等四、实验方法与步骤1．培养基的制备与灭菌按配制培养基的方法配制MS基本培养基250mL。
根据实验目的，采用培养基配方为MS+6BA( mg/L) +NAA( mg/L)。
所有培养基均附加30g/L蔗糖，4g/L琼脂粉。
在高压灭菌前将pH用1mol/LNaOH调至5.8，然后分装到三角瓶，每瓶分装培养基大约40-50mL。
2．试剂、无菌水及培养皿的准备配制75%的酒精、0.1%升汞；将蒸馏水装入三角瓶或广口瓶，每瓶装50-60 mL，按照培养基灭菌的方法灭菌30min，即可获得无菌水；将剪裁好的滤纸放入洗净的培养皿中，每培养皿放3层，加少量蒸馏水润湿后，用牛皮纸或两层报纸将培养皿包严，高压灭菌30 min后备用。
3．接种室准备首先，用纱布蘸取75%酒精擦拭工作台台面，将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于工作台上，打开工作台开关和紫外线灯，确认工作台正常送风后，开机30 min。
然后，用喷雾器向接种室空中喷洒75%酒精或打开接种室内的紫外线灯，进行空气灭菌。
4. 培养材料的表面灭菌从盆栽烟草植株上选取鲜绿、肥厚且充分展开的叶子，先用自来水冲洗30 min，用蒸馏水漂洗3次，然后在无菌条件下将其剪成适宜大小，放入广口瓶中。
先倒入75%酒精，摇动两三下（10s），立即将酒精倒出，然后加入0.1%升汞溶液，浸泡7min。
注意加入的升汞溶液应浸过叶片，浸泡过程中要不断摇动。
最后，将升汞倾出，加入无菌水摇动20-30 s倒出，重复用无菌水冲洗5次，备用。
5. 接种将经过表面灭菌的叶片按照无菌操作的要求取出，放入打开的无菌培养皿内。
愈伤组织培养
主要教学内容
愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织的继代培养 愈伤组织的形态发生及调控 愈伤组织培养的应用
愈伤组织
一、愈伤组织的诱导与分化
愈伤组织，原是指植物受伤之后于伤口表面形成 的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指外植体的 增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞。
一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织。 由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始。
复习思考题
1、愈伤组织形态发生的影响
？
因子有哪些？如何进行调节？ 2、愈伤组织培养在植物育种 中的应用有哪几方面？
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
地，节省人力、物力，手续简便，易于远 距离运输，而且不受病虫害的侵袭，便于 交流的优点。
（3）提供育种中间材料 通过组织培养可获得不同性质的愈伤组
织，可为原生质分离、融合或遗传转化提 供优质材料。 （4）可诱导和筛选突变体
（5）制造人工种子 为某些濒危和珍贵物种的繁殖，提供一
种高效的手段。
（二）培养基
1．生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控 制芽和根形成的重要条件之一。细胞分裂素/生 长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时， 有利于根的形成。
2．无机营养元素 营养元素的缺失会导致愈伤 组织生长不良，如： 缺铁：细胞分裂停止； 缺氮：细胞过度生长，形成层组织减退。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。
实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。
实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。
2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。
3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。
将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。
4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。
5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。
结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。
经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。
通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。
结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。
实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。
第四章之二愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型
一、定义 callus
在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无 特定结构和功能的薄壁细胞团。 二、愈伤组织的起始条件
创伤+激素
★机械性创伤 ★微生物入侵
★昆虫袭击
三、来源
植物各种器官、组织、细胞均有产生愈 伤组织的潜在可能性
★光照 暗 弱光 ★温度 20-30℃ ★培养基
N源 NH4+/NO3C源 蔗糖
激素 生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L
细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L
二、愈伤组织的形成过程
特点
愈伤组织形成
起始期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱 分化，愈伤组织结构疏松，缺少组 织结构，颜色浅而透明
形成期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改
变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
❖ **诱导期长短因植物种类、外植体的生理状 态和外部因素而异，即使同一种物种不同基 因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。
0.056
80d
0.253 0.227 0.219 0.124
0.063
第四章之二愈伤组织的诱导、 形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型 第一节 愈伤组织的诱导和形成 第三节 愈伤组织的继代及其生长分析 第四节 愈伤组织形态建成 第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础
实验二植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的分化与高再生能力基因型的筛选教学提纲
离体条件下植物细胞的脱分化和再分化
细胞脱分化（dedifferentiation) 是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了
细胞分工，使之回复到分生组织状态，或 胚性细胞状态。
愈伤组织(callus)：脱分化后的细胞，往往
胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通 过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中 取得营养。
很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条 件下长成一株植物。
类似于动物胚胎早期的发育
发育早期2次均等分裂 胚 胎 细 胞 发 生
胚 结 构 形 成
体细胞胚胎发生途径
➢ 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接 地发生，大致分为五种：
实验二 植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的 分化与高再生能力基因型的筛选
实验目的
理解植物细胞全能性的概念及应用。 了解并掌握植物体细胞胚胎发生的过程和途径。 了解植物体细胞胚胎发生的影响因素。 了解紫花苜蓿高胚状体发生基因型筛选的原理
与方法。
实验原理
植物细胞全能性(totipotent) ：
实验步骤：
胚状体分化与高胚状体发生基因型的筛选 将不同植株上形成的胚状体转移到新鲜的 21-28d后观察胚状体分化状况 挑选高胚状体发生基因型，取分化成苗的基因型
的叶柄转入新鲜的愈伤组织分化培养基中进行 新一轮的选择。 未生根的植株转入生根培养基中生根。
实验结果与分析
一些重要实验现象可用数码相机照相，存入电 脑，保存电子照片。
器官发生
➢ 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细 胞团（愈伤组织）分化形成不定根
（adventitious roots）、不定芽 （adventitious shoots）等器官的过程。
第二章： 愈伤组织培养
一）、 愈伤组织形成
1 、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细
胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定 状态。
在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成 分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起 源。
根发生在组织的深处，与整体植株发生类似， 是内起源。
愈伤组织的外部形态也随分化而改变，一般 由疏松转向紧密。
• 无论在MS还是在H或B5培养基中，不附加激素2, 4-D均不能诱导 扁桃花药愈伤组织的形成，
• 扁桃花药在H+1.0mg/L 2,4-D的培养基上诱导率最高为47%;在 MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上诱导率为67.0%;在B5+0.5～ 1.0mg/L2,4-D，出愈率都在84.0%以上，其中以2,4-D为0.5mg/L时， 出愈率高达100%.。说明在扁桃花药诱导过程中，最适基本培养 基是B5，最佳 2,4-D浓度为0.5mg/L。
分裂期：
外植体(explant)中已分 化的活细胞在外源激素的作 用下，外植体外层细胞出现 了分裂，由于外层细胞的迅 速分裂使得这些细胞的体积 缩小，逐渐回复到分生组织 状态，该时期细胞通过脱分 化的起动期而进入分裂，并 开始形成愈伤组织。
分裂期特征：
生理生化上分裂期的一个明显特征 是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不 分裂。另外还有细胞数目增加，体积变 小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量 达到最高等。
• 此时期的愈伤组织：细胞分裂快， 结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅 而透明。
分裂期愈伤组织
形成期：
• 细胞分裂从分裂期的周缘细胞分 裂为主逐渐转向内部的组织细胞， 愈伤组织表层细胞分裂减缓或停 止，内部深层细胞分裂并形成像 维管束或类似于分生组织组成的 鸟巢状结构的次生组织。
细胞实验报告
《细胞工程》综合实验——水稻愈伤组织的诱导和分化摘要本实验以水稻成熟种子为实验材料，通过NB诱导、分化培养基培养，诱导出愈伤组织并使其分化形成新的水稻幼苗。
在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
消毒效果的好坏，直接决定后期培养的成功率。
如果染菌率太高，后期培养可能无法继续下去。
本次实验就是通过组织培养的整个过程，来了解各个步骤的相关知识。
关键词：水稻愈伤组织诱导再分化目录1 前言 (3)2 材料与方法 (4)2.1 仪器 (4)2.2 设备 (4)2.3 试剂 (4)2.4 实验材料 (4)3实验方法 (5)3.1 配母液 (5)3.2 配NB诱导、分化培养基 (5)3.3 高温高压灭菌 (6)3.4 接种室、培养基及用具表面消毒 (6)3.5 消毒剂的配制 (6)3.6 种子去壳 (6)3.7 外植体消毒 (7)3.8 接种与观察（愈伤组织的诱导） (7)3.9 愈伤组织的再分化观察 (7)4 实验结果 (7)4.1愈伤组织的诱导与分化 (7)4.2 实验结果分析 (9)5 讨论分析 (11)5.1愈伤组织的诱导问题分析 (11)5.2愈伤组织再分化问题分析 (12)5.3 操作分析 (13)参考文献 (14)1 前言在我国,愈伤组织的培养和应用已经越来越多以及成熟，如：优良植株的无性繁殖、无病毒植株的获得、优良植株的选育等等。
同时，随着消费者对产品安全性要求的日益提高，植物细胞培养的应用已愈来愈广泛，如：药用代谢产物的制造、作为天然食品或者食品添加剂、杀虫剂和杀菌剂、饲料等，不仅更安全，而且能很好地解决现今产品出现的各种问题。
第三章_愈伤组织诱导及分化调控
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
愈伤组织的培养(2)
12
二、愈伤组织器官的形成
1、器官分化：如茎、根
（1）器官分化再生植株的方式：
①先芽后根：最常见； ②先根后芽：较少见； ③同时形成根和芽：在愈伤组织不同部位分别形成根和芽，相互
注：细胞脱分化在多数情况下形成愈伤组织，但也可直接分化为胚
性细胞形成体细胞胚或组织、器官。
7
三、愈伤组织的生长和调控
1、愈伤组织生长的特点：
①发生在不与琼脂培养基接触的表面； ②不同植物材料、在不同的培养条件下表面不同。
2、优良愈伤组织的特性：至少2-3项
①高度的胚性或再分化能力，能再生植株； ②分散性好，容易散碎，便于建立优良的悬浮系或分离原生质体； ③旺盛的自我增殖能力，容易扩大规模； ④经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作。
3、细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生：
（1）胡萝卜细胞悬浮培养物中存在两种类型的细胞：
①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞 一般不具备胚胎发生潜力；
②成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成 胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。
（2）胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其 外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向 的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构；另一个细 胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内 的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体 细胞胚。
1、胚胎发生：形成胚状体； 2、器官生生：形成芽、根，最终形成完整植株。
（二）细胞分化和组织分化： 二、愈伤组织器官的形成 ： 三、体细胞胚胎发生：
愈伤组织培养
分裂期
是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞 的过程。
外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅 速分裂，使细胞脱分化。
在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深 刻的变化：
•
1.数目迅速增加。 2.平均鲜重下降。 3.体积小，内无液泡。 4．核和核仁增大到最大。
•
形成期
是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结 构的愈伤组织的时期。
•
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
•
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
•
•青苹果愈伤组织增殖培养
•
•乌桕愈伤组织增殖培养
•
三 愈伤组织的形态发生
形态建成：外植体在适宜的培养条件下经 过脱分化和再分化形成完整植株的过程。
在组织培养中，从外植体形成器官或无性 系的形态发生，有下面两种方式：
•
形态发生方式（一）
不定芽方式 指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植 株。这是组织培养中常见的器官发生方式。
这一时期愈伤组织内细胞的特点是： ①大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松 散的。 ②细胞增殖速度快,适合用液体培养或悬浮培养。
•
③生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽 ，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变 为黄色甚至褐色。
•
•愈伤组织形成
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实验二 愈伤组织的诱导与再分化
一、目的
掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料
水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
四、仪器设备及用具
（一） 仪器设备
超净工作台 培养室
（二） 用具（每组5人用量）
量筒：100ml ×2
培养皿：￠9cm ×1
三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1
枪形镊：×4
无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5
五、试剂及培养基
（一） 试剂
75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml)
(二) 培养基
1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l
2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l
六、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒
用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制
（1）、75%酒精：每组配95ml 。
量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可.
（2）、2%NaCLO ：每组配100ml.
x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数；
y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。
3、种子去壳
用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。
每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）
将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 y X= (ml)
分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
5、接种与观察
愈伤组织诱导
将吸干的种子接入培养基，注意使胚朝上。
每瓶接10粒，每人2瓶。
写上日期、接种人、放入培养室25℃暗培养。
1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。
6、愈伤组织的再分化观察
在无菌条件下将诱导获得的愈伤组织（从约3周后安排此实验），从原材料中用镊子剥离后，接种到分化培养基中，每瓶接种4粒，每个同学接种3瓶，后置于光照条件下控制培养（25℃，2000lux 每天光照10小时下培养），观察分化出苗的状况（一般需要2-3个星期的培养时间）。
1个月后调查计算分化率。
七、结果与分析
1． 如何降低污染率？
2． 愈伤组织的形成、愈伤组织再分化与哪些因素有关？
分化率(%)= ×l00 分化植株的愈伤块数 ×100
形成愈伤组织的种子数
污染率(%)=
×100 污染的种子数 接种的总种子数 诱导率 (%)=
接种的总种子数 接种的总块数。