第二章 基因工程的载体和工具酶_PPT幻灯片
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8 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×10min， 弃上清，将沉淀在室温下晾干
9 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
溶液 I
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA，pH 8.0
5 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
6 加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min
7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min
开环双螺旋 （OC构型）
线状双螺旋 （L构型）
（二）质粒DNA的制备
分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析 柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括 培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA 分开及除去蛋白质和RNA。
碱变性法质粒提取的原理
在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共 价闭合环状质粒DNA却不会被变性。
在pH值介于12.0 -12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构 解旋变性。共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链 彼此相互盘绕，紧密地结合在一起
溶液III
3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸（pH4.8）
加入后就会有大量的沉淀，是因为SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸 钾（potassium dodecylsulfate, PDS），PDS是水不溶的，因此发生了沉 淀；高浓度的盐(3 M醋酸钾) ，使得沉淀更完全；溶液III加入并混合均 匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点
Tris-HCl控制溶液的pH
葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因 此如果缺了葡萄糖几乎没有影响；
EDTA螯合是Ca2+和Mg2+等二价金属离子，高达10 mM 的EDTA就 是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制 DNase的活性，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，如果 不加EDTA也不用怕DNA会迅速被降解
溶液II
0.2 N NaOH / 1% SDS
用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用；新鲜的 0.4 N的NaOH是保证NaOH溶液没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性，因为破裂细胞的主要是碱，而不是SDS；
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性 条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然 基因组DNA也会断裂，基因组DNA的断裂会带来麻烦
2 取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000rpm，1min， 弃上清
3 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，重悬，使菌体分 散混匀
4 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振 荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液 Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）
不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同 的生长环境也可能有很密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共 存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
（一）质粒的生物学特性
⑹ 质粒的转移
是否含有接 合转移基因
转移性质粒，含有tra基因；能通过结合 作用从一个细胞转移到另一个细胞。
非转移性质粒，不含tra基因；可以为转 移性质粒所带动转移。
在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间 有一定的相关性。现归纳如下：
接合型质粒 分子量大 严紧型复制
非接合型质粒 分子量小 松弛型复制
（一）质粒的生物学特性
（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双 螺旋三种
双螺旋共价闭合 环（SC构型）
通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成 网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线 性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀， 获得质粒DNA。
碱裂解法提取质粒
1 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3.0ml LB（含相 应抗生素）液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜（约 16-17hr）。
第一节 载 体
基因克隆的目的是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、 不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借 助于“载体”及其“寄主细胞”来实现
作为基因克隆的载体必须具备以下特性
⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。
另外长时间的碱性条件会打断DNA，基因组DNA一旦发生断裂成50－100 kb 大小的片断，就不会被PDS共沉淀；所以碱处理的时间要短，而且不得激 烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入
一 质粒载体（plasimid vectors）
（一）质粒载体的生物学特性 （二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造 （四）几个常用质粒载体
（一）质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
根据拷贝数将质粒分为两种复制型： “严紧型”质粒（stigent plasmid），拷贝数为1-3； “松弛型”质粒（relaxed plasmid），拷贝数为10-60。
2M的醋酸是为了中和NaOH，调pH值至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两 条互补链仍保持在一起，因而复性迅速而准确；而线性染色体DNA的两条 互补链因彼此已完全分开，复性缓慢且错误率高，缠绕形成网状结构 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将 绝大部分蛋白质沉淀了；
尽管SDS并不与DNA分子结合，由于染色体DNA太长且缠绕形成网状结构， 大肠杆菌的基因组DNA也同时被共沉淀
9 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
溶液 I
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA，pH 8.0
5 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
6 加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min
7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min
开环双螺旋 （OC构型）
线状双螺旋 （L构型）
（二）质粒DNA的制备
分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析 柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括 培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA 分开及除去蛋白质和RNA。
碱变性法质粒提取的原理
在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共 价闭合环状质粒DNA却不会被变性。
在pH值介于12.0 -12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构 解旋变性。共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链 彼此相互盘绕，紧密地结合在一起
溶液III
3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸（pH4.8）
加入后就会有大量的沉淀，是因为SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸 钾（potassium dodecylsulfate, PDS），PDS是水不溶的，因此发生了沉 淀；高浓度的盐(3 M醋酸钾) ，使得沉淀更完全；溶液III加入并混合均 匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点
Tris-HCl控制溶液的pH
葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因 此如果缺了葡萄糖几乎没有影响；
EDTA螯合是Ca2+和Mg2+等二价金属离子，高达10 mM 的EDTA就 是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制 DNase的活性，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，如果 不加EDTA也不用怕DNA会迅速被降解
溶液II
0.2 N NaOH / 1% SDS
用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用；新鲜的 0.4 N的NaOH是保证NaOH溶液没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性，因为破裂细胞的主要是碱，而不是SDS；
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性 条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然 基因组DNA也会断裂，基因组DNA的断裂会带来麻烦
2 取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000rpm，1min， 弃上清
3 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，重悬，使菌体分 散混匀
4 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振 荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液 Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）
不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同 的生长环境也可能有很密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共 存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
（一）质粒的生物学特性
⑹ 质粒的转移
是否含有接 合转移基因
转移性质粒，含有tra基因；能通过结合 作用从一个细胞转移到另一个细胞。
非转移性质粒，不含tra基因；可以为转 移性质粒所带动转移。
在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间 有一定的相关性。现归纳如下：
接合型质粒 分子量大 严紧型复制
非接合型质粒 分子量小 松弛型复制
（一）质粒的生物学特性
（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双 螺旋三种
双螺旋共价闭合 环（SC构型）
通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成 网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线 性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀， 获得质粒DNA。
碱裂解法提取质粒
1 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3.0ml LB（含相 应抗生素）液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜（约 16-17hr）。
第一节 载 体
基因克隆的目的是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、 不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借 助于“载体”及其“寄主细胞”来实现
作为基因克隆的载体必须具备以下特性
⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。
另外长时间的碱性条件会打断DNA，基因组DNA一旦发生断裂成50－100 kb 大小的片断，就不会被PDS共沉淀；所以碱处理的时间要短，而且不得激 烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入
一 质粒载体（plasimid vectors）
（一）质粒载体的生物学特性 （二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造 （四）几个常用质粒载体
（一）质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
根据拷贝数将质粒分为两种复制型： “严紧型”质粒（stigent plasmid），拷贝数为1-3； “松弛型”质粒（relaxed plasmid），拷贝数为10-60。
2M的醋酸是为了中和NaOH，调pH值至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两 条互补链仍保持在一起，因而复性迅速而准确；而线性染色体DNA的两条 互补链因彼此已完全分开，复性缓慢且错误率高，缠绕形成网状结构 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将 绝大部分蛋白质沉淀了；
尽管SDS并不与DNA分子结合，由于染色体DNA太长且缠绕形成网状结构， 大肠杆菌的基因组DNA也同时被共沉淀