诱导多功能干细胞研究涉及的技术

综述

诱导多功能干细胞研究涉及的技术

作者李建雄09级七年制二系093335 摘要

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是体细胞在外源因子作用下，经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞．iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值．在过去几年中，科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破．本文就iPS细胞研究关键环节—一诱导系统涉及的技术进行综述与展望。

关键词

体细胞重编程，诱导多潜能干细胞, 整合型载体,非整合型载体，新型载体，蛋白质转染, 细胞膜的通透性观察，DNA甲基化, RNA干扰实验，信号通路

引言

干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制能力、高度增殖及多向分化潜能，从发现之日起一直倍受学者关注。20世纪末以来，胚胎干细胞成为各国研究的重点。然而，胚胎干细胞的获取主要还是来自早期发育的囊胚，而这一阶段涉及许多对生命的界定问题，各国因信仰、民俗及文化背景的不同引起胚胎干细胞研究激烈而敏感的伦理之争；同时，胚胎干细胞的获取和保存也受现实条件的限制。因此，怎样采用非胚胎材料直接产生多能性干细胞成为生命科学研究发展的重要瓶颈。作为细胞重编程研究的里程碑，2006年，Yamanaka小组“将Oct4、Sox2、c．Myc和KH4等4个转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblasts，MEFs)中，成功获得与小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在表型、生长特性、基因表达和分化潜能等方面高度相似的小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell) 【1】，从此，iPS细胞的研究日趋火热。美国Thomson 小组报道了通过转染Oct-4、Sox2、Nanog及Lin284个基因可将人的成纤维母细胞重编程为iPS细胞【2】。iPS细胞在其形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传修饰上都与ESCs无显著差别【3-4】，研究表明：鼠iPS细胞能有效分化为造血和神经祖细胞，并能在体内和体外分化为血液及神经系统的各种细胞【5-6】。亦有研究证明，人体iPS细胞和小鼠iPS 细胞均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞【7-9】；同时，iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性”【10】。但到目前为止，iPS细胞的研究才刚刚起步，一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决，iPS细胞走向临床应用为时尚早。本文就近几年iPS 细胞研究所涉及的技术作一回顾，从具体操作上把握iPS 研究和应用方向，加深对ips的认识，以期对有志于此的医学生未来的学习研究工作有所帮助．

1、基因导入技术

把已知基因转移到真核细胞,并且整合到基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入。基因导入技术是制备ips细胞的主要技术，而基因载体又是推动无遗传修饰ips细胞的建立的关键。载体主要有整合型载体、非整合型载体以及新型载体。

1.1.整合型载体介导的基因导入技术

早期使用的病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单一慢病毒载体及piggyBac转座子都属于整合型载体【11】。反转录病毒载体的结构包括已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，以及两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。逆转录病毒载体制备首先要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，另外还具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，

PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env 不同。

1.2.非整合型载体介导的基因导入技术

腺病毒载体、RNA病毒、附着体和质粒都属于非整合型载体。腺病毒载体[27]、RNA 病毒[28-29]、附着体[30]和质粒[25,31]等非整合型载体已成功制备iPS 细胞，但重编程效率往往较整合型载体低．而且也存在载体基因污染、转基因表达难以精确调控和引起癌变风险

1.3.新型载体介导的基因导入技术

新型载体中非病毒微环状载体能高效率制备无遗传修饰ips细胞，最近研究发现，仅病毒载体也能重编程体细胞为ips细胞。Jia 等[25]建立非病毒微环状载体携带Oct4、Sox2、Lin28 和Naong(reprogramming cassette，使用2A 肽段和IRES，高效表达4 个转录因子)诱导脂肪干细胞重编程为iPS 细胞，该载体能高效率制备无遗传修饰iPS 细胞．最近研究[26]发现，仅病毒载体也能重编程体细胞为iPS 细胞，这一发现为利用基因导入技术获取iPS 细胞提供新思路．此外，能高效诱导iPS 细胞的重组腺病毒载体，该载体能高效调控并介导体细胞重编程为iPS 细胞【13-24】。

2、蛋白质转染技术

2.1蛋白质转染诱导ips细胞

为克服当前基因操作风险，丁胜研究组首次采用蛋白质转染技术制备iPS 细胞[32]，添加化学小分子丙戊酸(valproic acid，VPA)情况下，融合穿膜肽11R (poly-arginine) 的蛋白质组合11R-Oct4、11R-Sox2、11R-Klf4、11R-c-Myc 和11R-Oct4、11R-Sox2、11R-Klf4 2 种组合分别将小鼠成纤维细胞重编程为iPS 细胞．随后，Kim 研究组[33]使用融合穿膜肽9R(poly-arginine)的蛋白质组合9R-Oct4、9R-Sox2、9R-Klf4、9R-c-Myc 重编程人新生儿成纤维细胞为iPS 细胞．蛋白质转染技术制备的iPS细胞无任何遗传修饰，避免了基因操作和毒副化学物质带给iPS 细胞的潜在风险，提高了临床应用安全性．蛋白质高效转染技术存在三个核心问题：a．如何实现蛋白质从培养基进入细胞浆；b．怎样避免蛋白质被溶酶体持续俘获；c．如何保证蛋白质从胞浆正确入核．钱其军等通过建立高效双穿膜肽系统【11】，重编程蛋白被核转运蛋白复合体识别而高效入核的同时，导入能破坏蛋白质穿膜时形成巨胞饮泡的小肽，使蛋白质被释放，避免被溶酶体捕获降解．除利用穿膜肽做蛋白质载体外，也可通过增加细胞膜通透性或纳米隧道途径使蛋白质进入细胞，如链球溶菌素O(streptolysin-O, SLO)可增加细胞通透性使ES 细胞提取物进入293T 细胞[35].此外，是否仅用酶来催化相关蛋白实现重编程也有待研究．细胞膜的通透性研究也为蛋白质从胞浆入核提供了依据。

3、化学药物诱导技术

体细胞重编程效率低(＜0.01%[1, 36])且动力学缓慢(2～3 周)，极大制约iPS 细胞研究与应用。化学物质可以提高重编程效率，并且能功能性替代某些转录因子，其主要通过影响细胞表观遗传修饰和信号转导通路发挥作用。

3.1 表观遗传途径

表观遗传修饰在体细胞重编程程中有着重要作用，化学小分子可通过改变体细胞的DNA 甲基[38-39]、组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)[37]等表观遗传特性提高重编程效率。