克隆性分析的临床应用 - 副本

患者信息
• 基因芯片检出结 果联合EZH2、 TP53基因突变对 OS、EFS的影响。
1 MDS克隆性基因突变套餐（20种）
目的：寻找MDS病态造血的克隆性证据，辅助疾病亚型分类及 预后判断。 适用人群：疑似MDS患者 指标权威参考： 覆盖WHO指南、NCCN指南所提到的基因突变 指标 覆盖深度： 检出率大于10%——TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、 检出率在5-10%——EZH2、ZRSR2、STAG2、NRAS
几个概念，助于理解何为致病性

单核苷酸多态性（SNP）与非多态性位点突变的鉴别
SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

胚系突变与获得性突变的鉴别
胚系突变：基因突变通过卵子和/精子传递，导致几乎所有的胚 胎细胞都存在相同的突变，这种突变可以代代相传。 获得性突变：后天由于某种原因导致的体细胞发生的突变。
• • 特异性诊断价值的克隆性证据寻找（如-7/7q-、-5/5q-、 -13/13q-、11q-等。 ）以辅助MDS的诊断。 与其他非克隆性疾病的鉴别诊断（AA、IRP等）
MDS的预后判断
• 对染色体异常的全面检出，更能契合IPSS-R预后系统的分层评估。
作为细胞遗传学的补充手段，提高染色体异常检出率。（单 亲二倍体、缺失、扩增更高的检出率）
备注：MDS需多指标综合诊断，此种联合也必须建立在骨髓细胞学、骨髓 活检、常规染色体分析等方面检测的基础之上。
对61例MDS/CMML患者联合评估
来自百度文库
材料和方法
• 韩国8个医院收集经WHO分类的61位MDS/CMML 患者，将地西他滨用于一线治疗方案。
染色体核型 分析 IPSS分组 治疗前基因芯 片检测 临床跟踪 分析
内容
MDS与克隆性 染色体异常与MDS的克隆性
基因突变与MDS的克隆性
基因芯片与基因突变的联合应用
1 MDS患者的染色体异常
40-60%MDS患者具有非随机的染色体异常。
MDS中染色体异常及比例（WH0 2008）
2 染色体的诊断价值
难治性血细胞减少，遗传 学异常 与MDS特异性较高的染色体 核型包括:-7/7q-、-5/5q-、 -13/13q-、11q-、12p/t(12p)及平衡性易位如 t(11;16)、t(3;21)、t(1;3)、 t(2;11)等。
骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）
基因芯片技术
骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）

单亲二倍体：是指一对同源染色体全部来自父亲或母亲。UPD分为遗传性和获 得性两种，获得性UPD在癌症的发展过程起重要的作用。

20%的MDS患者表现为获得性UPD，获得性UPD可导致受累基因的纯合突变， 在MDS患者中通常表现为MDS相关基因的纯合突变。
基因突变与克隆性
基因突变的积累会导致正常细胞获得恶性克隆。 从MDS阶段到sAML阶段分子克隆是一个演化的过程。（分子克隆的
种类逐渐增加，各克隆的所占比例也发生较大变化。）
N Engl J Med 2012;366:1090-8.
4 MDS的单克隆性分析的重要性
维也纳诊断标准中明确提出染色体、基因突变克隆性分 析的重要性
5 全基因组芯片
原理
Microarray: 探针包埋在固相支撑物上 提供丰富的生物信息
寡核苷酸探针客服了分辨率的 局限: The DNA probes在2580 bp长度间 在1.28×1.28cm上能够 包含650w个生物探针 在检测CNV方面数据质 量极高 可以发展成为能够检测非 CNV的突变, e.g. LOH, UPD and IBD区域. 可以用于genotyping
2 髓系肿瘤高频基因突变（30种）
目的：AML、MDS、MPN/MDS等疾病的高频基因突变检测
适用人群：疑似MDS患者、AML患者
覆盖广度： MDS检出率大于10%——TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、
U2AF1、TP53、RUNX1
AML检出率在10%——IDH1、IDH2、FLT3/ITD、NPM1、KIT、CEBPA、

MDS的病人同时存在许多表观遗传控制基因的突变, 如 ASXL1、DNMT3A、EZH2、IDH1、IDH2和TET2等。 通过对这些基因突变的检测可进一步预测MDS是否会 对去甲基化药物发生反应。

4.2 TP53与来那度胺
骨髓增生异常综合征诊断与治疗专家共识（2012版）
5 临床应用小结 基因突变小结
IPSS-R +MDS 基因突变分析套 餐 诊断与鉴别 诊断 来那度胺治 疗：TP53 基因突变
预后判断
用药指导 去甲基化药 物： ASXL1、 DNMT3A、 EZH2、 IDH1、 IDH2和 TET2
免疫制剂治 疗（ATG、 环孢素）： HLA-DR15 基因检测
环状铁粒幼细 胞 与SF3B1 MDS 基因突 变分析套餐
内容
MDS与克隆性 染色体异常与MDS的克隆性
基因突变与MDS的克隆性
基因芯片与基因突变的联合应用
联合二者综合分析
基因突变
某些基因位点突变分析
基因芯片
染色体的高分辨分析，可检出染 色体扩增、缺失、单亲二倍体/杂 合性缺失
二个方法联 合，可全面 捕获MDS 克隆证据， 提高检出率。
基因突变克隆性分析的关键
确定基因突变的致病性，是克隆造血的关键证据！
无 临 床 意 义 有 临 床 意 义
MDS相 关基因 突变检 测
突 变 位 点
多 态 性
胚 系 突 变 获 得 性 突 变
非 多 态 性
会导致克隆性 造血的点突变
确定胚系突变的临床 意义： 患者病因确定，调 整治疗方案。 造血干细胞移植供 者筛查。 患者的遗传咨询， 及定期随访。
del(20q)、+8、-Y
当形态学证据不充足时 可以诊断为MDS
当形态学证据不充足时 不能推测为MDS
3 染色体的预后价值
4 染色体检测手段的要求
染色体核型分
析至少20个骨
髓细胞的中期 分裂象，阳性
检出率低
骨髓增生异常综合征中国专家共 识（2014版）
FISH检测
FISH对染色体检测阳性率可以达到50%，但 是探针数量有限。
Rafael Bejar. haematologica 2014; 99(6)
3.3基因突变数量影响预后
携带的基因突变数量和种类越多， 疾病的预后分层越差，进展越快， 转化为AML的几率越高。
Haematologica. 2014 Jun;99(6):956-964.
4 临床指导用药
4.1去甲基化药物敏感性预测
• 基因芯片可提高染色体异常检出率。MDS染色体异常的阳性检出率为 78%，其中20%阳性异常为UPD；而染色体核型+FISH的检出率为59%。
• 不同的预后分组的MDS患者结合基因芯片结果后，OS存在较大差异
Blood-2011-Tiu-4552-60
芯片临床应用时机
MDS的诊断与鉴别诊断
U2AF1、TP53、RUNX1
检出率在2-5%——BCOR、SETBP1、IDH1、IDH2、ETV6、JAK2、
CBL、KRAS
胚系与获得性鉴别：
无 临 床 意 义 有 临 床 意 义
MDS相 关基因 突变检 测
突 变 位 点
多 态 性
胚 系 突 变 获 得 性 突 变
非 多 态 性
髓系肿瘤中常见 的胚系突变 （RUNX1、 ETV6等）可导致 克隆性造血 已明确的获得性 突变导致MDS的 克隆性造血
内容
MDS与克隆性 染色体异常与MDS的克隆性
基因突变与MDS的克隆性
基因芯片与基因突变的联合应用
基因突变里程碑式的进展
1987年首次报道MDS患者存在基因突变
2011年报道：核型正常的MDS患者，近50%存在基因突变
2014年：MDS中国版专家共识将常见的几种基因突变纳入其中
Millions of locations available on each GeneChip array The probes are all between 25 and 49 bp in length
基因芯片可检测染色体扩增/缺失/单亲二倍体
芯片检测结果提示
基因芯片在临床应用的意义
基因突变克隆性分析的临床应用
1 提示克隆性造血的存在，为诊断提供参考依据。
2017版NCCN指南明确提出：基因突变，可提示MDS的克隆性造血的存在。
对于无法确诊的MDS患者，基因突变的克隆性分析，可以提供辅助标准指标。
2 辅助疾病亚类的鉴别
MDS伴单系病态造血 MDS伴多系病态造血 MDS伴环形铁粒幼细胞
北京海思特临床检验所有限公司 2017-07-20
内容
MDS与克隆性 染色体异常与MDS的克隆性
基因突变与MDS的克隆性
基因芯片与基因突变的联合应用
1 MDS疾病的概述
特点
是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞发育 异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病 （AML）转化。
3.2 SF3B1与环形铁粒幼细胞的相关性
血红素合成 的基因表达 异常 •
线粒体 铁代谢 异常
在MDS或MDS/MPN患者中，存在SF3B1基因突变时，出现伴有环形铁粒幼细胞的 可能性为97.7%，而SF3B1基因不突变时，97.8%的可能性不会出现环形铁粒幼细胞。
Blood，2013（121）：260-269
MDS 是不明原因导致的癌性造血克隆逐渐扩增，引起的正常造血衰竭 性疾病。
癌性克隆出现 癌性细胞↑ 正常血细胞↓ dysplasia pancytopenia Hb↓WBC↓PLT ↓
正常
癌性克隆获增殖优势
normal
MDS
AML
3 MDS的单克隆细胞群的标记
染色体与克隆性
至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排，或者至少3个细胞有同样 的染色体丢失，方可确认存在1个异常克隆。 ————《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》 血液肿瘤患者的染色体畸变常呈克隆性，此种克隆性明确提示疾病的 恶性本质。
3 辅助疾病的预后判断 3.1 SF3B1基因突变
若存在SF3B1基因突变，提示预后较好。 RARS MDS-RS
Rui Cui,et al. Leukemia Research.2012,36:1428
3.2 影响危险分级—TP53, EZH2, ETV6, RUNX1, ASXL1
在IPSS-R预后分级为极低危、低危、中危的患者，若存在 TP53, EZH2, ETV6, RUNX1, ASXL1突变中的任何一种，预后较差。
SF3B1基因突变，可作为 MDS疾病亚型的分类。
3.1 SF3B1基因

SF3B1 基因定位于2q33 ，是RNA剪切因子 常见的剪切因子有SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、等，这类基因的突 变存在互相排斥性，即在同一例患者中几乎只出现其中1个基因突变
Yoshida et al., Nature, 2011
DNMT3A、NRAS、WT1
JMML相关基因：KRAS、NRAS、CBL、PTPN11、NF1、SETBP1 CMML相关基因：TET2、SRSF2、ASXL1 其他 ——BCOR、BCORL1、STAG2、PIGA、PHF6、JAK2、EZH2、ETV6、ZRSR2
3 送检标本要求
项目 MDS克隆性基因突变套 同时采集检测样 餐（20种） 本和验证样本 髓系肿瘤高频基因突变 （30种） 标本要求 检测样本：骨髓3-5mL,EDTA 抗凝 验证样本：口腔黏膜、头发、 指甲
骨髓3-5mL,EDTA抗凝
（1）口腔黏膜： 采样前30分钟内禁止吃东西、喝水或任何饮料。采样时，用力刮取两侧脸颊内口腔黏膜，左右脸颊 都要刮，每侧10次，共刮取3-4根棉签），棉签在空气中自然晾干2h后，保存于EP管或无菌管中， 4℃保存，72h送检。 （2）头发： 清洗头发后，2小时内取头发5-6根（要求带有明显的毛囊组织），保存于EP管中，4℃保存，72h 送检。 （3）指甲： 指甲清洗干净后，取5-10mm长，1-2mm宽的指甲块，3-4块，常温保存于EP管中送检。
核出芽
核 碎 裂
核间桥
骨髓增生异常综合征分类——WHO2016版
关键词： 病态造血 单系或多系 环形铁粒幼细胞
病态造血
MDS的病态造血细胞主要来
自于恶性克隆。
病态造血可以反映MDS的本 质，但不是MDS所特有 疾病诊断的根本，证明病态造 血是MDS克隆所致
2 MDS疾病的本质