转录组测序(RNA-Seq)--杨军

合集下载

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。

深度为10-30 Million reads。

）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。

大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。

我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。

这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。

首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。

接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。

然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。

再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。

对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。

这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。

也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。

因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。

高通量测序技术在基因组学和转录组学研究中的应用

高通量测序技术在基因组学和转录组学研究中的应用高通量测序技术（high-throughput sequencing technology），也被称为第二代测序技术，是一种革命性的基因组学工具，可用于研究基因组和转录组中的DNA和RNA序列。

自2005年首次商业化以来，高通量测序技术已经迅速发展，并成为了现代遗传学和生物学的重要工具。

它的广泛应用为研究人类及其他生物体的基因组序列带来了新的机遇，从而推动了基因组学和转录组学研究领域的快速发展。

高通量测序技术的应用范围非常广泛，包括但不限于以下几个方面：1. 基因组重测序（whole genome sequencing, WGS）：高通量测序技术可以在较短时间内低成本地测序出一个个体的全部基因组序列。

这种技术的快速发展大大降低了测序的成本和时间，从而使人们能够更广泛地研究不同生物个体之间的遗传差异，进而揭示出许多与疾病相关的基因变异。

2. 转录组测序（RNA-Seq）：高通量测序技术可以帮助科学家研究转录组中的RNA序列。

RNA-Seq技术可以揭示不同条件下细胞中的基因表达变化情况，包括甲基化修饰、剪接变异、新的外显子等，从而帮助科学家理解基因表达的调控机制和生物过程中的复杂性。

3. 亚基因组测序（exome sequencing）：高通量测序技术可以专门测序编码蛋白质的基因组区域，即外显子。

由于外显子占据了基因组的大部分功能区域，亚基因组测序可以更加高效地发现与疾病相关的基因变异。

这种技术被广泛应用于遗传病的基因诊断和研究。

4. 转录组组装（transcriptome assembly）：高通量测序技术可以生成RNA序列的大量数据，进而帮助科学家重建转录组的组装情况。

转录组组装技术允许科学家识别转录本、识别新的转录本和非编码RNA，从而深入了解基因转录和基因调控的细节。

5. 蛋白质-核酸相互作用（protein-nucleic acid interaction）：高通量测序技术可以在全基因组水平上分析蛋白质与核酸之间的相互作用。

杨军教授简介

杨军教授简介一、个人简介杨军男，1973年生，博士，教授，硕士生导师。

生物技术教研室主任，中国细胞生物学会会员，中国空间科学学会会员。

以先后承担了本科生遗传学、细胞生物学、生物化学、植物生理学、细胞工程、生物制药技术和研究生植物细胞工程、体细胞遗传学等课程的教学工作。

目前主要从事植物细胞组织培养、遗传转化、植物次生代谢产物分析分离，以及航天育种的研究工作。

先后主持省部级项目4项，校级项目1项，参与主研国家和省部级项目5项，发表论文63篇，其中有12篇被SCI收录。

2005年获西华师范大学优秀教学管理干部，2007年获西华师范大学优秀青年教师。

二、科研论著清单（共63篇，其中被SCI收录12篇，CSCD收录18篇, *为通讯作者论文）：（一）、SCI收录的论文(12篇)：1.Yang J, Hu Z, Guo G Q, Zheng G C. In vitro plant regeneration from cotyledon explants ofSwainsona salsula Taubert. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2001, 66(1): 35-39 (SCI收录)2.Yang Jun,Yu Chun-hong, Wang Xin-yu, Zheng Guo-chang (Cheng K C). Ultrastructuralobservation on the intra- and intercellular microtrabecular network in pollen mother cells of onion. Acta Botanica Sinica, 2001, 43(4): 331-338 （SCI收录）3.Hu Z, Yang J, Guo G Q, Zheng G C. high efficiency transformation of Lycium barbarummediated by Agrobacterium tumfaciens and transgenic plant regeneration via somatic embryogenesis. Plant Cell Reports, 2002, 21:233-237 (SCI收录)4.Li W, Yang J, Pan Y F, Guo G Q, Zheng G C. Chromosome localization of genes that controlsynchronous development of pollen mother cells in wheat. Caryologia, 2003, 56（3）: 275-279（SCI收录）（第2作者，共5人）5.Gao H H, Li W, Yang J, Wang Y, Guo G Q, Zheng G C. Effect of 6-benzyladenine and caseinhydrolysate on micropropagation of Amorpha fruticosa. Biologia Plantarum, 2003/4,47(1): 148-148（SCI收录）6.Peng Z S, Yang J,Wei S H, Zeng J H. Characterization of the common wheat (Triticumaecetivum L.) mutation line producing three pistls in a floret. Hereditas, 2004, 141: 15-18（SCI收录）7.Hou W R，Du Y J，Yu Chen，Xia Wu，Peng Z S，Yang J，Zhou C Q. Nucleotide sequenceof cDNA encoding the mitochondrial precursor protein of the ATPase inhibitor from the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). DNA and Cell Biology，2007，26（11）：799-802 (SCI收录)8.Hou W R，Chen Y，Hu J C，Peng Z S，Y ang J，Tang Z X，Zhou C Q，Li Y M，YangS K，Du Y J，Kong L L，Ren Z L，Zhang H Y，Shuai S R. A complete mitochondrial genome sequence of Asian blank bear Sichuan subapecies (Ursus thibetanus mupinensis).International Journal of Biological Science 2007, 3(2): 85-90 (SCI收录)9.Yang J., Gong Z. C. Tan X. Induction of callus and extraction of alkaloid from Yi Mu Cao(Leonurus heterophylus Sw.) culture. African J Biotech，2008, 7 (8)：1157-1162（SCI收录）10.Li J.T., Yang J., Chen D.C., Zhang X.L. and Tang Z.S. An optimized mini-preparationmethod to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower. Genetics andMolecular Research，2007，6 (4): 1064-1071 （SCI收录）*11.Cao H, Yang J, Peng ZS, Kang C Y, Chen D C, Gong Z C, Tan X. Micropropagation ofPenthorum chinense through axillary buds. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant, 2007, 43: 149-153 (SCI收录) *12.Wang Li-Qiang, Yang Jun,Deng E, Wang Guang-Bi, Peng Zheng-Song. Optimizing theshoot proliferation protocol of Penthorum chinense by axillary buds. Biotechnol Lett (2008) 30:2199–2203(SCI收录) *（二）、CSCD收录的论文（12篇）：1.Yang Jun, Gao Huan-huan, Li Wei, Zheng Guo-chang. Cytoskeleton in plasmodesmata andcytoplasmic channels of onion pollen mother cells. Acta Botanica Boreall-Occidentalia Sinica, 2002, 22(3): 521-5252.胡忠，杨军，郭光沁，郑国锠。

RNA-Seq项目常见问题与解答

RNA-Seq项目常见问题与解答这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。

在我们接触的转录组项目中，有些老师对项目分析结果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。

那么春天来了，花儿开了，今天福利也到了，我们特意将转录组项目中常见的一些问题进行了汇总，各位老师可以按需自取哈。

1．如何判定生物学重复一致性的高低？生物学重复统计方法及公式答：（1）皮尔逊相关系数r可以作为生物学重复相关性的评估指标，理想的生物学重复试验r2≧0.92。

考虑到个体差异、取材环境、时间以及人员操作熟练程度等因素对测序数据的影响，一般r2≧0.8为可接受范围。

（2）Pearson（皮尔逊）相关系数：皮尔逊相关也称为积差相关（或积矩相关）是英国统计学家皮尔逊于20世纪提出的一种计算直线相关的方法。

2．DEG基因用Transcripts还是Unigenes？答：DEG基因用的是Unigene。

3．transcript-id代表什么意思？为什么有的基因有多个transcript-id？答：基因转录本id；因为可变剪切的缘故，一个基因可能有多个转录本。

4．在miRNA鉴定中，可能成为miRNA的reads是怎样计算的？哪些条件会影响到mrd值？micro RNA在不同组织有异构体的存在，是如何处理的？答：与 Rfam， miRbase， RepBase和 Exon\Intro 序列库进行比对，获得 sRNA 注释信息，以此作为预测新的 miRNA 的基础。

miRNA的鉴定是利用miRDeep2软件进行已知及新（保守及非保守）的miRNA鉴定。

miDeep2会在reads比对到基因组上的位置两端分别延伸75、15bp进行结构预测，此软件认为极可能与可能是miRNA的根据是通过mrd值来区分的，mrd>-10为可能，mrd>0为极可能；影响mrd值的有reads在基因组上的分布和碱基结合的自由能等；5．对于有生物学重复的项目，怎样计算差异基因？答：两两比对使用的是R的EBseq包, 是基于负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，重复间的比对使用的是R的DEseq包，是基于分层贝叶斯模型的原理对组合内样品进行分析。

检测基因表达变化的方法

检测基因表达变化的方法基因表达变化是指基因在特定条件下转录和翻译水平的变化。

检测基因表达变化的方法有很多种，以下是几种常用的方法：1. 转录组测序（RNA-seq）转录组测序是一种基于高通量测序技术的方法，可以检测基因在不同条件下的转录水平。

该方法首先从细胞中提取总RNA，然后通过建库、测序和分析得到每个基因的转录本序列。

通过比较不同条件下的转录本序列，可以发现基因表达的变化。

RNA-seq具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，适用于研究基因表达的复杂性和动态性。

2. 定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）qRT-PCR是一种基于PCR技术的方法，可以检测特定基因的表达水平。

该方法首先从细胞中提取总RNA，然后通过反转录得到cDNA，再通过PCR扩增得到目的片段。

通过比较不同条件下的目的片段拷贝数，可以发现基因表达的变化。

qRT-PCR具有高灵敏度、高特异性和可重复性好等优点，适用于验证RNA-seq等高通量测序方法的结果。

3. 微阵列分析微阵列分析是一种基于芯片技术的方法，可以同时检测多个基因的表达水平。

该方法将已知序列的探针集成在芯片上，然后将待测的cDNA或RNA与探针进行杂交。

通过检测杂交信号的强度，可以发现基因表达的变化。

微阵列分析具有高通量、高效率和高灵敏度等优点，适用于大规模的基因表达谱研究。

4. 原位杂交原位杂交是一种将探针与组织切片上的目标基因进行杂交的方法，可以检测目标基因在组织中的表达位置和表达水平。

该方法将探针与组织切片上的目标基因进行杂交，然后通过荧光或免疫组化等方法显色标记杂交信号。

通过观察杂交信号的数量和分布，可以发现基因表达的变化。

原位杂交具有高特异性、高灵敏度和定位准确等优点，适用于研究基因表达的组织特异性。

5. 免疫组织化学免疫组织化学是一种利用抗体与目标蛋白进行特异性结合的方法，可以检测目标蛋白在组织中的表达位置和表达水平。

该方法将抗体与目标蛋白进行特异性结合，然后通过显色标记抗体结合的位置。

转录组测序概述及实验分析流程（分享）

转录组测序概述及实验分析流程（分享）⼀、转录组测序概述转录组是特定物种、组织或细胞类型转录的所有RNA（转录本）的集合，包括mRNA和⾮编码RNA(Non-coding RNA，⾮编码RNA⼜包括：tRNA，rRNA，snoRNA，microRNA，piRNA，lncRNA等。

通过⽐较转录组或基因表达谱的研究以揭⽰⽣物学现象或疾病发⽣的分⼦机制是⾼通量组学研究的⼀个常⽤策略。

利⽤⾼通量测序技术研究转录组在全⾯快速得到基因表达谱变化的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的cSNP（编码序列单核苷酸多态性）、可变剪接等序列及结构变异，另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势。

⼆、研究转录组⽅法有哪些⽬前研究转录组的⽅法主要三种：1. 基于杂交技术的cDNA芯⽚和寡聚核苷酸芯⽚2. 基于sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallelsignature sequencing)3. 基于第⼆代测序技术的转录组测序，⼜称为RNA-Seq。

三、转录组测序有什么样的样品要求？（1）样品纯度要求： OD值应在1.8⾄2.2之间；电泳检测28S:18S⾄少⼤于1.8。

（2）样品浓度： totalRNA浓度不低于400ng/µg。

（3）total RNA样品请置于-20℃保存；请提供totalRNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。

请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。

（4）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管⼝使⽤Parafilm封⼝。

建议使⽤⼲冰运输，并且尽量选⽤较快的邮递⽅式，以降低运输过程中样品降解的可能性。

四、转录组测序需要多⼤的测序量才能得到有意义的结果？转录组测序前，需要对物种转录组的⼤⼩进⾏评估，评估⽅法如下：（1）对于有reference genome的物种，可以分析基因组信息，统计编码基因的个数，及其碱基数，从⽽估计物种转录组的⼤⼩，另外可以查询相关或相近物种转录组研究的⽂献，作为参考。

转录组测序（RNA-seq）技术

转录组测序（RNA-seq）技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。

转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。

相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

技术优势：数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。

任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。

同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。

更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。

应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。

图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异康成生物提供的RNA-se q技术服务实验流程：1. 样品RNA准备2. 测序文库构建使用oligo dT微珠纯化mRNAmRNA片段化处理反转录反应合成合成双链cDNA双链DNA末端修复及3’末端加‘A’使用特定的测序接头连接DNA片段两端高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3. DNA成簇（Cluster）扩增4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）5. 数据分析原始数据读取与数据库比对并进行注释深层次数据分析6. 提供实验报告原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。

rnaseq 转录组测序实验方案

rnaseq 转录组测序实验方案RNA测序（RNA-Seq）是一种新兴的高通量测序技术，可用于研究转录组的整体表达特征和mRNA表达数量的变化。

本文将讨论RNA 测序实验方案，包括样品处理、测序方法和数据分析。

一、样品处理在进行RNA测序实验之前，需要注意以下几个步骤：1. 样品收集：从研究对象中收集组织样品或细胞，注意采集得到的RNA是代表性的并且不受任何处理的影响。

2. RNA提取：使用合适的方法提取总RNA或mRNA。

总RNA适用于研究全转录组表达水平的变化，而mRNA主要用于研究特定基因的表达。

二、测序方法RNA测序通常分为以下几个步骤：1. 文库制备：将RNA样品转录为cDNA，进行文库建立。

可以使用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA，以增加测序信号。

2. 测序平台选择：根据实验需求和预算，选择合适的测序平台，如Illumina HiSeq、Ion Torrent或PacBio等。

3. 测序深度：根据样品复杂度和研究目的，确定所需的测序深度。

较低的深度适用于检测高表达基因，而较高的深度适用于检测低表达基因或罕见突变。

三、数据分析RNA测序数据分析是整个实验的重要环节，以下是常用的数据分析步骤：1. 数据质控：使用质控工具（如FastQC）对测序数据进行质量评估，去除低质量的reads和接头序列。

2. 游离核酸去除：使用工具（如Trimmomatic）去除rRNA或tRNA 等非编码RNA。

3. 序列比对：使用参考基因组进行序列比对，如使用Bowtie、BWA等工具。

对于未知基因组，可选择进行de novo组装。

4. 表达差异分析：通过比较每个基因在不同样品中的表达量，确定差异表达基因。

常用的工具包括DESeq、edgeR等。

5. 功能注释：将差异表达基因进行功能注释，了解其在生物学过程中的作用。

可以使用GO、KEGG等数据库进行注释。

6. 数据可视化：将分析结果通过图表或热图进行可视化，更直观地展示差异表达基因和通路的变化。

rna-seq转录组的测序技术

RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。

而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。

二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。

通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。

2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。

目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。

高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。

三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。

2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。

3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。

四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。

2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。

3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。

RNA测序与转录组分析技术

RNA测序与转录组分析技术近年来，随着生物学研究的深入和技术的发展，RNA测序（RNA-Seq）和转录组分析技术成为了生命科学领域中最受关注的研究手段之一。

通过RNA测序和转录组分析，研究人员能够全面了解基因的表达情况和调控机制，从而深入研究生物体的发育、疾病机制、细胞信号传导以及环境应答等方面。

本文将对RNA测序技术、转录组分析技术以及其应用领域进行探讨。

一、RNA测序技术RNA测序技术是一种通过高通量测序，对生物样本中的RNA分子进行全面、精确的分析的技术手段。

它的发展使得研究人员可以在转录水平上揭示基因组的整体特征和调控机制。

从技术原理上来看，RNA测序主要包括样品准备、文库构建、测序、数据分析等步骤。

首先，样品准备是RNA测序中不可忽视的一步。

研究人员应当选择适当的样本来源，并对其进行RNA提取以获取稳定的RNA样品。

其次，文库构建是RNA测序的核心过程之一。

它包括RNA的逆转录、合成cDNA、文库构建、文库质控等步骤。

文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果。

然后，测序过程是RNA测序的关键环节。

现代测序技术，如Illumina测序，通过高通量、并行测序的方式，快速扫描个体样本中RNA的序列信息。

最后，数据分析是RNA测序的最后一步。

通过生物信息学分析，可以获取到RNA测序数据的注释信息、表达水平以及差异表达基因等结果，为后续的转录组分析提供支持。

二、转录组分析技术转录组分析是对RNA测序数据进行解读和分析，旨在探究基因表达谱的变化以及相关调控机制。

通过转录组分析，研究人员可以从全局角度获取到基因表达的动态信息。

常见的转录组分析包括差异表达分析、富集分析、路径分析等。

首先，差异表达分析是一种常用的转录组分析方法。

通过比较不同样本间的RNA测序数据，可以找到表达差异显著的基因。

这一方法能够帮助研究人员对不同样本间的基因表达差异进行分析，并筛选出和特定生理过程或疾病相关的差异表达基因。

其次，富集分析是一种将差异表达基因与生物学功能关联起来的方法。

转录组测序以及常用算法简介

转录组测序以及常用算法简介转录组测序，也被称为“全转录组鸟枪法测序”（WTSS），由于转录组测序的高覆盖率，它也被称为深度测序。

它主要利用新一代高通量测序技术，对物种或组织的RNA反转录而成的cDNA文库进行测序，并得到相关的RNA信息。

其研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。

它是指用新一代高通量测序技术，对物种或组织的RNA反转录而成的cDNA文库进行测序，并得到相关的RNA信息。

转录组测序根据有无基因组参考序列分为：有参考基因组的转录组测序，和无参考基因组的de novo测序。

如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，而这些遗传信息可以广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究中。

虽然转录组测序和基因组测序的步骤大体相同，但是在文库制备和分析方法上却有很大的区别。

在生物信息学领域，序列比对作为识别DNA、RNA和蛋白质相似区域的有效手段，有助于我们更好地研究其结构、功能以及进化方向的关系。

下图简要说明了转录组测序的主要流程：首先将细胞中所有的反转录产物转化为cDNA文库，再将cDNA随机剪切为小DNA片段，并在两端加上接头（Adapter），所得序列通过比对（有参考基因组）或者从头组装de novo（无参考基因组），形成全基因组范围的转录谱。

图1 转录组测序流程图常用算法简介TopHat（/software/tophat/index.shtml）TopHat是Cole Trapnell等人于2009年发表在Bioinformatics上的基于Bowtie的转录组测序比对算法，是马里兰大学生物信息和计算机生物中心，以及加利福尼亚大学伯克利分校数学系和分子细胞生物学系以及哈佛大学的干细胞与再生生物学系联合开发的结果。

它通过超快的高通量短序列比对RNA序列来识别剪切位点。

图2 TopHat流程图TopHat首先先用Bowtie将RNA序列与整个参考基因组进行比对，找到匹配的序列，再用Maq合并匹配的序列，对外显子进行选择性的拼接。

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。

RNA—Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段（reads）数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。

文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA—Seq的研究平台，着重介绍RNA—Seq 的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA—Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。

关键词: RNA-Seq；原理应用；方法;挑战；发展前景Abstract：Transcriptome sequencing （RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome。

RNA—Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads）numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence，the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information，has been widely used in biological research，medical research，clinical research and drug development。

转录组学研究方法

转录组学研究方法转录组学是研究细胞、组织或生物体在特定条件下的全部转录产物的方法。

它通过对RNA序列的定量和定性分析，揭示了基因表达的状态和调控机制，为生物体的发育、生长和适应环境等生物学过程提供了重要的信息。

本文将介绍转录组学的主要研究方法。

1. RNA测序（RNA-Seq）RNA测序是转录组学研究中最常用的方法之一、它通过对RNA样品进行逆转录、建库、测序等步骤，获得RNA序列信息，并通过生物信息学分析来确定转录本的表达水平、剪接异构体和单核苷酸变异等。

RNA测序技术可以全面地分析转录本的全集，不受参考基因组限制，并可以检测新的转录本和非编码RNA。

2.差异表达基因分析差异表达基因分析用于确定在不同组织、时间点或处理条件下表达量发生变化的基因。

通过比较不同样品中的转录组数据，可以鉴定出差异表达的基因，并进行进一步的功能注释和富集分析。

差异表达基因分析可以帮助我们确定与特定生物过程相关的基因。

3.转录因子结合位点分析转录因子结合位点分析可以鉴定转录因子结合到基因组DNA上的位点，从而揭示基因转录的调控网络。

这个方法基于转录因子的特异性结合序列（转录因子结合位点，TFBS）的预测模型，通过对转录组数据进行生物信息学分析，可以预测出可能的转录因子结合位点。

4.全基因组的基因表达谱研究全基因组的基因表达谱研究可以同时分析细胞或组织中所有基因的表达水平，在不同条件下对比不同样品的表达谱，可以鉴定出哪些基因在不同条件下具有相似或相反的表达模式。

这种方法可以帮助我们理解基因调控网络和准确鉴定基因功能。

5.基于蛋白质-RNA相互作用的研究基于蛋白质-RNA相互作用的研究可以揭示转录后调控的机制。

这种方法通过分析RNA与蛋白质之间的相互作用，鉴定RNA结合蛋白质的结合位点和关键蛋白质，从而确定蛋白质对转录后调控的功能。

总结起来，转录组学的研究方法包括RNA测序、差异表达基因分析、转录因子结合位点分析、全基因组的基因表达谱研究和基于蛋白质-RNA 相互作用的研究。

转录组研究新技术RNASeq及其应用

转录组研究新技术RNASeq及其应用一、本文概述随着生物信息学和分子生物学的快速发展，转录组研究已成为解析生命活动重要机制的关键手段。

近年来，新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）的崛起，特别是RNA测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）技术的广泛应用，极大地推动了转录组学研究的深度和广度。

RNA-Seq技术以其高分辨率、高灵敏度和高定量的特性，在基因表达分析、非编码RNA研究、基因结构变异分析等领域展现出强大的潜力。

本文旨在全面介绍RNA-Seq技术的基本原理、实验流程、数据分析方法，以及其在生命科学各领域中的实际应用，以期为相关研究人员提供有益的参考和启示。

二、RNASeq技术概述RNA测序（RNASeq）是一种革命性的技术，极大地推动了转录组学的研究进程。

该技术基于下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）平台，可以对生物样本中的RNA进行全面、精确的测序和分析。

RNASeq不仅提供了转录本的序列信息，还能够揭示转录本的表达水平、剪接方式、变异情况以及基因结构等重要信息。

RNASeq的实验流程通常包括样本制备、文库构建、测序和数据分析等步骤。

在样本制备阶段，需要提取高质量的RNA，并通过一系列的处理步骤去除杂质和降解的RNA。

文库构建是RNASeq技术的核心，其目标是将RNA片段化、反转录成cDNA，并构建成适合测序的文库。

测序阶段则利用NGS平台对文库进行高通量测序，获得大量的序列数据。

数据分析是RNASeq技术的另一个关键环节。

通过对测序数据的处理和分析，可以鉴定出转录本、评估基因表达水平、发现可变剪接事件、识别基因融合以及探索非编码RNA等。

RNASeq技术还可以与表观遗传学、蛋白质组学等其他组学技术相结合，从多个层面揭示生命活动的复杂性和多样性。

RNASeq技术的应用范围非常广泛，涵盖了基础生物学研究、疾病机理探索、药物研发等多个领域。

基于RNA测序的转录组分析技术

基于RNA测序的转录组分析技术RNA测序（RNA-Seq）技术是近年来生物医学领域发展最快、最引人注目的研究技术之一。

RNA-Seq技术以高通量的方法快速地测序RNA样本中的所有RNA，包括编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA），从而全面了解转录组中遗传信息的表达情况和调控机制。

一、 RNA测序技术的优势相对于传统的Sanger测序，RNA-Seq技术有以下优势：1.高通量，能快速测序大量RNA分子，获得全面丰富的转录组信息。

2.扩展性强，能够检测所有RNA分子类型（编码、非编码RNA），能支持多种样本类型的测序（细胞、组织、血清等）。

3.高灵敏度，能够检测低表达的RNA，同时对表达水平动态变化很敏感，有助于发现新的生物学过程。

4.高精度，优异的测序深度和覆盖度可使结果更加可靠。

二、 RNA测序技术的应用RNA测序技术在基础研究和临床诊断等方面都有广泛的应用。

1.发现新的RNA分子类型：利用RNA-Seq技术可以发现新的RNA分子类型，如Circular RNA（circRNA）、Long non-coding RNA（lncRNA）等，对了解RNA基因调控机制有重要意义。

2.全面理解基因调控网络：RNA-Seq技术可以发现与基因调控相关的RNA分子和代谢物，从而全面理解基因调控网络。

3.疾病基础研究：RNA-Seq技术可用于发现疾病相关的RNA 分子和调控途径，如肿瘤、神经退行性疾病等，是研究疾病机制和筛选治疗靶点的重要工具。

4.患者个性化诊断和治疗：RNA-Seq技术可以发现患者个体基因表达的差异，从而为个性化治疗和诊断提供基础。

三、 RNA测序技术的分析流程RNA测序技术的分析流程一般包括以下步骤：（1）RNA提取和质检：选择适当的RNA样本，进行RNA提取和质检，确保RNA质量达到要求。

（2）文库构建：根据测序需求选择不同的文库构建方式，如，随机分段转录组文库、chain termination转录组文库等。

单细胞转录组测序技术原理及其应用

单细胞转录组测序技术原理及其应用随着基因组学技术的飞速发展，单细胞转录组测序（Single-cell RNA-Seq）技术逐渐成熟，能够对单个细胞的基因表达情况进行高通量的测定，为生命科学研究提供了前所未有的工具和机会。

本文将介绍单细胞转录组测序技术的原理及其应用。

单细胞转录组测序技术主要包括以下几个步骤：1. 单细胞的分离单细胞转录组测序技术是指对单个细胞进行RNA测序的技术，因此需要将细胞进行简单的分离。

可使用离心、离子交换、贴壁等方式进行细胞的分离。

不同的细胞类型在细胞膜蛋白、表观遗传标记等方面各不相同，因此需要针对不同的细胞类型使用不同的筛选方法，如基于荧光分选或微流控芯片分选等。

单细胞的捕获是单细胞转录组测序的关键步骤之一，其中最常用的方法是微滴分离法（Drop-seq）。

整个过程大致分为三个步骤：① 在一个含有芯片或微型装置的系统中，将单个细胞和一定量的对应量的RNA捕获位点混合在一起。

② 加入GEM转录本测序试剂盒（GEMs），将单细胞、珠子和反应试剂在液滴中混合，形成油-水-珠（Emulsion）结构。

GEMs主要是MDA（多位移扩增）试剂盒和CIS（化学切割等离子）试剂盒。

③ 通过破裂珠子，提取RNA，然后去除DNA和其他杂质，制备RNA测序文库。

3. 测序将单细胞RNA测序文库经过高通量测序技术进行测序，生成大量的读取长度通常为50 bp的测序数据。

4. 数据处理对测序数据进行拼接、去除低质量序列、去除重复序列等质量控制过程，然后将拼接后的数据与参考基因组注释文件进行比对，确定每个基因的表达情况。

最终，可以获得每个单细胞中每个基因的表达谱信息。

1. 发现新的细胞类型和细胞亚群单细胞转录组测序技术可以帮助研究人员发现新的细胞类型和细胞亚群，尤其是那些在组织和器官中难以鉴定的稀有细胞类型。

通过对单细胞转录组数据进行聚类分析，可以将细胞按照其基因表达谱的相似性进行分类。

2. 了解细胞发育和分化过程3. 鉴定不同疾病状态下的细胞分布和功能变化单细胞测序技术还可以帮助研究人员鉴定不同疾病状态下的细胞分布和功能变化。

RNA-seq

RNA-Seq的核心是二代DNA测序技术，它应该是迄今为止应用最为广泛的高通量转录组测序方法。

mRNA—Seq的文库制备与测序方法过程如下:首先分离出样本细胞组织中的RNA，用Poly（T）寡聚核苷酸提取Poly（A）+RNA。

然后对Poly（A)+RNA 进行片段化处理，接着利用随机引物和反转录酶合成cDNA,再合成双链cDNA，之后对cDNA进行末端修复并添加测序链头。

为了提高测序效率，通常采用电泳切胶法提取一定长度范围的cDNA，再对其进行PCR扩增，最终得到cDNA 文库。

若文库制备遵循链特异性协议，可为后续数据处理阶段的转录组重建及表达水平估计提供转录本的方向信息。

在测序阶段，将制备完成的cDNA文库放入测序平台的通道内.测序仪器先对cDNA进行PCR扩增，之后开始测序.测序主要通过检测荧光信号来确定测得的碱基及顺序，其过程又称作“洗和检测”.按照是否从cDNA两端测序,RNA-Seq可分为单端和双端两张方式，维修红双端测序能提供更准确的转录本信息,这有助于基因表达水平的估计。

测序产生的核苷酸序列被称为“读段”，其长度范围为35-500碱基。

一般来说，测序深度越高，产生的读段数据量也越大。

二代测序已能一次产生超过500千兆碱基的读段序列.相对与传统的转录组信息挖掘方法，RNA-Seq具有如下优点：1.测序对象不局限于已知基因组。

例如,RNA-Seq已被用于非模式生物的转录组测序；2。

RNA-Seq可准确检测到转录边界和剪接位点；3.由于大部分RNA-Seq读段能够唯一映射至基因组，因此相对于微阵列，RNA—Seq的背景噪声更低；4。

RNA —Seq读段数量的动态范围广，更有利于表达水平量化分析；5.可重复性高,生物学重复的相关系数达到0。

93-0。

95,技术重复的相关系数达到0。

99。

RNA—Seq序列（又称为“读段")的特点是长度短（25-200bp）、可靠性高，几乎每一条读段都能反映其所对应的RNA序列信息。

代谢组学及其应用_杨军

21卷1期2005年1月生　物　工　程　学　报Chinese J ou rnal o f Biotechnology Vol .21　No .1January 2005R eceived :July 6,2004;Accepted :August 23,2004.This work was supported by Grant from the High -technology Development Pl an “863project ”(No .2003AA223061)of State M inistry of Science and Technol -ogy of China and the Knowledge Innovati on Program of the Chinese Academy of Sciences (No .K2003A16).＊Corres ponding author .Tel :86-411-83693403;E -mail :dicp402@mail .dlptt .ln .cn863计划(No .2003AA223061)和中国科学院知识创新工程领域前沿课题(No .K2003A16)。

代谢组学及其应用Metabonomics and its Applications杨　军1,宋硕林2,Jose Castro -Perez 3,Robert S .Plumb 4,许国旺1＊YANG Jun 1,SONG Shuo -Lin 2,Jose Castro -Perez 3,Robert S .Plumb 4and XU Guo -Wang 1＊1.中国科学院大连化学物理研究所,大连　1160111.Nat ion al Ch ro mato g ra ph ic R .&A .C ente r ,Da lian Ins titute o f Ch emica l Physi cs ,C hin es e A cad emy of Sci enc es ,Da lian 116011,C hin a2.Nih on W ater sK .K .,140-0001To kyo ,Ja pa n3.Wa ter s Co r p o rati on ,Ma nch est er ,U K4.Wa ter s Co r p o rati on ,Milfo r d MA ,US A摘　要　对代谢组学的概念、特性、发展历史做了简要介绍,综述了当前代谢组学研究中的数据采集、数据分析中采用的技术,及代谢组学在疾病诊断、药物毒性研究、植物和微生物等领域的应用,并对代谢组学的发展作了展望。