插入突变克隆讲义
《基因突变》 讲义
《基因突变》讲义一、什么是基因突变基因突变，简单来说，就是指基因在结构上发生了碱基对组成或排列顺序的改变。
我们每个人的身体都是由无数个细胞组成的，而在每个细胞的细胞核中，都存在着携带遗传信息的染色体。
染色体由 DNA 组成，DNA 则是由一个个碱基对按照特定的顺序排列而成。
就好像是一本长长的密码书，碱基对的排列顺序决定了生命的各种特征和功能。
当这本“密码书”中的某些碱基对发生了变化，比如增添、缺失或者替换，就会导致基因发生突变。
基因突变可以发生在生殖细胞中，也可以发生在体细胞中。
二、基因突变的原因基因突变的产生，往往有着多种原因。
首先，自然环境中的一些因素可能导致基因突变。
例如，紫外线、X 射线等各种辐射，它们能够直接损伤 DNA 分子的结构，从而引发基因突变。
还有一些化学物质，像亚硝酸盐、黄曲霉素等，它们能够与DNA 发生反应，改变碱基对的组成和排列。
其次，生物体内自身的一些因素也可能引起基因突变。
在 DNA 复制的过程中，偶尔会出现错误，导致碱基对的配对不正确。
另外，细胞内的一些代谢产物或者活性氧分子，也有可能对 DNA 造成损伤。
此外，病毒的感染也可能导致基因突变。
病毒在侵入细胞后，其遗传物质可能会整合到宿主细胞的染色体中，从而引起基因结构的改变。
三、基因突变的类型基因突变的类型多种多样。
点突变是其中比较常见的一种类型，也就是单个碱基对的替换、增添或者缺失。
比如说，原本的碱基对是 AT，变成了 GC，这就是碱基对的替换。
还有一种是缺失突变，比如一段DNA 序列中的几个碱基对不见了。
插入突变则是在原本的 DNA 序列中插入了新的碱基对。
此外，染色体结构的变异也属于基因突变的范畴，比如染色体的缺失、重复、倒位和易位等。
四、基因突变的特点基因突变具有一些显著的特点。
首先是随机性。
基因突变可以发生在生物体发育的任何时期，也可以发生在细胞内的任何一个基因上。
其次是低频性。
在自然状态下，基因突变的频率通常是很低的。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
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实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
基因突变和基因重组(上课课件)
农业
遗传改良 农作物抗病虫害
环境
生物污染治理 污水处理
基因突变和基因重组的影响与风险
影响
基因突变和基因重组对生物进化、疾病发展和物种适应性产生重要影响。
风险
基因突变和基因重组引起的突变可能导致遗传疾病和不可预测的后果。
基因突变和基因重组的未来发展趋势
1
基因编辑技术的突破
CRISPR技术的出现使基因编辑变得更加精确和高效。
2
个性化基因治疗
将基因治疗定制为个体的基因型和健康需求。
3
环境基因工程的发展
利用基因重Leabharlann 技术改良环境中的微生物以解决环境污染问题。
基因突变和基因重组(上 课课件)
探索基因突变和基因重组的奥秘，了解它们的定义、原因、类型、分类，以 及其在生物学和医学领域中的意义和应用。
基因突变的定义和原因
1 什么是基因突变?
基因突变是DNA序列的改变，它可以发生 在一个或多个碱基对上。
2 基因突变的原因
基因突变可以由自然而然的突变、环境因 素、化学物质或放射线等引起。
遗传突变的类型和分类
点突变
点突变是单个碱基对的改变， 它可能会导致氨基酸序列的改 变。
插入突变
插入突变是DNA序列中插入一 个或多个碱基对。
删除突变
删除突变是DNA序列中删除一 个或多个碱基对。
基因重组的概念和意义
1 什么是基因重组?
基因重组是指DNA分子中发生片段的重组，与突变不同，它改变了基因的排列顺序。
2 基因重组的意义
基因重组是进化和生物多样性的重要驱动力，也是生物工程和基因治疗的基础。
基因重组技术的原理和方法
原理
基因重组技术利用DNA重组酶和DNA连壳酶来剪 切、重组和复制DNA分子。
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。
这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。
2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。
表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。
3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。
这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。
4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。
5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。
这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。
6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。
这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。
7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。
例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。
克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。
这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。
《DNA的突变》课件
汇报人：
突变传递：通过 有性生殖和无性 生殖进行传递
有性生殖：通过 受精过程将突变 传递给后代
无性生殖：通过细 胞分裂和克隆技术 将突变传递给后代
修复机制：DNA 修复酶识别并修 复DNA损伤
修复类型：包括碱 基切除修复、核苷 酸切除修复、错配 修复等
修复过程：识别损 伤、切除损伤、修 复损伤、验证修复
修复结果：修复成 功或失败，可能导 致细胞死亡或突变
技术进步：基因编辑技术的发展，如CRISPR-Cas9，为DNA突变的检测和预防提供了新的手段 预防策略：通过基因筛查和遗传咨询，提高公众对DNA突变的认识和预防意识 治疗方法：开发针对DNA突变的靶向治疗药物，提高治疗效果和患者生活质量 伦理问题：DNA突变研究的伦理问题，如基因编辑的伦理边界和隐私保护等，需要进一步探讨和解决
遗传因素：家族遗传病史 环境因素：生活习惯、饮食习惯等 心理因素：长期压力、焦虑等
碱基替换：一种碱基被另一种碱基替换 碱基插入：在DNA链中插入额外的碱基 碱基删除：在DNA链中删除一个或多个碱基 移码突变：DNA链中碱基的插入或删除导致蛋白质序列的改变
癌症：可能导致癌症的发生
遗传病：可能导致遗传病的 发生
添加标题
添加标题
遗传性疾病是由DNA突变引起的
添加标题
添加标题
DNA突变可能导致基因功能丧失或 改变，影响生物体的生理功能
DNA突变可能导致癌症的转 移和扩散
DNA突变可能导致癌症的发 生
DNA突变可能导致癌症的复 发和耐药性
DNA突变可能导致癌症的诊 断和治疗困难
DNA突变是生物进化的重要驱动力 DNA突变可以导致生物性状的改变 DNA突变可以产生新的基因，为进化提供原材料 DNA突变可以导致生物适应环境的变化，提高生存能力
8.2 拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定
拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定摘要利用T-DNA插入拟南芥基因引起突变，获得突变植株，提取16号植株细胞DNA，利用三引物法进行PCR扩增，检测得16号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在，为杂合突变体。
引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。
T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
植物材料——拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1)植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；(2)生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；(3)自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4)种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；(6)基因组小，只有5对染色体。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
插入诱变在拟南芥基因克隆中的应用
插入诱变在拟南芥基因克隆中的应用摘要随着各种基因克隆方法的建立,克隆的拟南芥基因越来越多,其中转座子标签和T-DNA插入诱变克隆的拟南芥基因的数目最多,插入诱变已成为克隆和鉴定很多重要植物基因的方法。
突变体在农业发展中起着重要作用,如苹果、玫瑰等许多园艺植物品种就是自然突变(芽变)经无性繁殖产生的。
人们一直利用物理或化学诱变剂诱使植物大量变异,获得植株突变体。
植物学家也利用这些突变体鉴定与克隆目的基因。
插入诱变剂包括转移DNA(T-DNAs)和转座成分(转座子),是植物分子生物学家克隆基因最普遍使用的诱变剂,这些诱变剂既能使基因失活,又可重获植物基因组DNA,这个过程就是众所周知的基因标签,它不但能验证突变的目的基因对植物生物化学与发育过程的重要性,而且克隆相关基因的方法较为简便,不需了解目的基因产物或在基因组中位置。
本文讨论插入诱变及拟南芥突变体基因的克隆。
1拟南芥遗传特性与烟草等易于基因标签的物种比,拟南芥更适合于植物遗传研究。
拟南芥矮小(株高为25~40cm),不需太大的生长空间;生长间期短(6~7周);自花授粉;结实率高(每株有5000~10000粒种子)等特性都有利于遗传分析。
最重要的是,拟南芥基因组较小(120000kb)和少量分散的重复DNA有利于功能基因的标签,分离基因的工作量少。
另外,拟南芥是一种开花植物,具有典型的植物细胞生理和发育过程,通常可假定拟南芥基因在其它大部分高等植物上具有相似的功能。
2T-DNAs在拟南芥基因克隆中的应用土壤根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefacien)的转移DNA的T-DNA,是Ti质粒上能够诱导肿瘤的DNA片断。
片断两端为25bp 的边界重复序列,当农杆菌侵染时,该片断转移到植物细胞并整合进基因组中。
该过程能否诱导突变,插入T-DNA中的基因和突变体共分离,要看T-DNA整合到基因组中的位置(基因或非编码的DNA中)。
T-DNA插入诱变在拟南芥(Arabidopsis)中应用最为成功,在已报道的20000多转化体中克隆了20多个基因。
转座子引起的插入突变
实验六转座子引起的插入突变一、实验目的通过实验进一步认识转座子的遗传学效应之一：转座可引起插入突变。
二、实验原理转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。
最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。
一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。
转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。
复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。
一旦形成复合转座子，IS 序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。
转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
转座作用的遗传学效应有如下几个方面，转座引起插入突变；转座产生新的基因；转座产生染色体畸变；转座引起的生物进化。
常见的大肠杆菌复合转座子的抗药性、大小、末端重复序列和转座特性转座子抗药性大小（bp）末端重复序列转座特异性转移频率Tn1 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn2 Ap 4800 140bp（反向）低有时高有时低Tn3 Ap 4600 140bp（反向）低一般低低Tn4 Su、Sm 20500 140bp（并带有Tn3）Tn5 Kan 5200 1460bp 低Tn6 Kan 4100 低Tn7 Tp、Kan 高低Tn9 Cm 2500 800bp（顺向）（实际上即IS1）Tn10 Tc 9300 1400bp（反向）一般（实际上即IS2）Ap：氨苄青霉素抗性Su：磺胺抗性Kan：卡那霉素抗性Sm：链霉素抗性Cm：氯霉素抗性Tc：四环素抗性Tp：甲氨苄氨嘧啶抗性大肠杆菌复合转座子的插入突变有两个表型效应：基因突变和由转座子带来的抗药性。
转座子的插入突变及转座子的应用课件
现在学习的是第1页，共18页
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易位 子，是指存在于染色体DNA上可以自主复 制和位移的一段DNA序列。 转座子可以在不同复制子之间转移，以非正 常重组方式从一个位点插入到另外一个位点， 对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效 应。
现在学习的是第2页，共18页
一、转座子的发现
• 转座子是1951年美国玉米遗传育种学家 Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒中 色斑不稳定现象而提出来的。
• 当时这是一个新概念，它突破了以往人们认 为基因在染色体上的位置是固定不变的认识， 所以一开始并不被大家接受，直到1967年 在大肠杆菌(E．coli)的半乳糖操纵子研究中 发现了这类插入序列，才得以被普遍认同。
特征：
1、转座后原来
位置上的转座 因子保切割
从 3’ 末端复制 产生共合体
重组
共合体
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接
交叉结构(单链转移复合
现在学习的是第10页，共18页
四、转座子的应用
❖基因的标定 ❖构建突变体库 ❖ 鉴别菌株及群体多样性 ❖生态环境污染的生物修复 ❖转基因生物的克隆
现在学习的是第6页，共18页
现在学习的是第7页，共18页
三、转座子的转座机制
据转座子的移动机制，转座可分为：
（一）复制型转座 （二）非复制型转座
现在学习的是第8页，共18页
转座酶结合在 Tn 两端
（一）非复 制型转座
特征
转座子末端被交错剪切
1、断裂和重接 反应使靶重构。
2、供体保持裂
缺。+
另一条链也被切
棉花黄萎病菌插入突变体库的构建及致病相关基因DVK1的克隆与鉴定
２Ｄｅａｔ ｎ ｏ Ｐａ ｔ ａ ｏｏｙ Ｃ ｉａ ｇｉｕｔ ａ ｎｖｒ ｔ Ｂ ｉｎ ０９ ， ｈｎ） ． ｐｒ ｍｅ ｔｆ ｌ Ｐ ｔ ｌ ， ｈ Ａ ｒ ห้องสมุดไป่ตู้ ｒｌ ｉｅ ｉ ， ｅ ｉ １ １３ Ｃ ／ａ ｎ ｈ ｇ ｎ ｃ ｕ Ｕ ｓｙ ｊｇ ０
Ａｂ ｔ ｃ ： ｉ ｓｕ ｙ ｗｅｃ ｒｉｄ ｏ ｔ — ｓｒ ｔ ｎ ｔ ｓ ｔ ｄ ， ａ ｒ ｕ ＤＮＡ ｓ ｒ ｏ ａ ｔ ｇ ｎ ｓｓｔ ｄ ｎ ｉ ｔｎ ｓ ｗｈｃ ｒ ｆｅ ｔ ｅ ｉ ａｈ ｇ ｎ ｃｔ ． ａ Ｉ ｈ ｅ Ｔ ｉ ｅｔ ｎ ｌ ｎ ｉ ｍｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｉｅ ｔ ｙ ｍｕａ ｔ， ｉｈ ａｅ ｅ ｆｃ ｖ ｐ ｔ ｏ ｅ ｉｉ ｏ ｆ ｉ ｎ ｙ Ｔｈ ｉ ｈｙ ｖ ｒ ｌｎ ， ｅｏ ｉｔ ｇ ｓ ａｎ ｗａ ｔｔ ｄ ｔｒ ｕ ｈ Ａｇ ｏ ａ ｔ ｉ ｍ ｕ ｆ ｃ ｅ ｓｍｅ ｉｔｄ ｔ ｎ ｆ ｒ ｔ ｎ ｎ ０ ０ ｅ ｈｇ ｌ ｉ ｅ ｔ ｄ ｆ ｌ ｉ ｔ ｉ ｓ ｍｕ ａｅ ｈ ｏ ｇ ｒ ｂ ｃｅ ｕ ｔ ｍｅａ ｉｎ － ｄ ａ ｅ ｒ ｓｏ ｍａ ｉ ，ａ ｄ ５ ０ ｕ ａｎ ｒ ｒ ａ ｏ
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３ ３ ｐ的 ＤＶＫ１全 长 ｃ ２ ７ｂ ＤＮＡ 序 列 ， 编码 １ ７ ０ ９个 氨 基酸 的蛋 白。基 于 ＤＮＡ 序列 比对 发 现 ， Ｋ１基 因含 有 ２ ＤＶ
转座子的插入突变及转座子的应用
下了一个双链缺口。
供体被释放
Tn 连接到靶上
图 23-43 Tn 的两条链先后被切割，然后转座子与切开 的靶位点连接。
（二）复制 型转座
特征：
1、转座后原 来位置上的 转座因子保 持不变；
2、转座过程 中有一共整 合体。
Tn 靶 单链交错切割
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接 交叉结构(单链转移复合
2、构建突变体库
正因为以上转座子的特征，转座子才 被广泛应用于构建插入突变体库，现 已成为研究基因功能的重要手段之一。 目前研究和应用得较多的有Tn10、 Tn5、Tn3和Mu噬菌体 。
3、鉴别菌株及群体多样性
转座子通常限制性地分布于特定的真 菌菌株或群体中，可以作为特定菌株 的诊断工具，已用于丝状真菌群体多 样性分析。在医药工业方面已用于有 益菌株的鉴别， 在植物病理学方面已 用于鉴别特定的病原 。
转座子的插入突变及转座子 的应用
主讲人:杨长友 本组成员:杨菊 孙青芝 陈骊君 陆朝军 杨长友
内容提要
一、转座子的发现 二、转座子的分类 三、转座子的转座机制 四、转座子的遗传效应 五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易 位子，是指存在于染色体DNA上可以自主 复制和位移的一段DNA序列。
从 3’ 末端复制 产生共合体
重组
共合体
四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的 模式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但 转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件 之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的 表达。
四、转座的遗传学效应
新克隆技术不用酶切位点,直接克隆
17 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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主要内容
1 In-Fusion®技术原理 2 In-Fusion®实验方法 3 In-Fusion®应用实例 4 In-Fusion®应用文献
18 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用
多片段克隆 插入突变
CD101, 2799-bp PCR Product Sense 5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′ Antisense 5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′
Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR Product Sense 5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′ Antisense (SalI underlined) 5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′
x μl**
dH2O μTol tal Volume
x 10 μl
Linearized vector : Purified PCR fragment(摩尔比)=1:2 *<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng **<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng
24 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用实例---插入突变
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直到1961年，Jacob和Monod的乳糖操纵模 型核控制理论发表之后， McClintock，的 “控制因子”假说才开始重新引起人们的注意。 之后，于60年代末，J.A.Shapiro 在研究大肠 杆菌高效突变时，首次，在细菌中发现了移动 基因。
值得庆幸的是,尽管麦克林托克采用了孟 德尔式的工作方式,利用了大体相同 的 实验材料(都是高等植物),得出了相同性 质的超时代发现,也遭受了大体相同的命 运,但她毕竟在晚年看到了自己理论的胜 利,并获得了科学界的最高奖励—因,它附近的 一个控制因子Ds(称为离解因子或分化变异因 子)以一定的速率关闭SG,使玉米籽粒不能产生 紫色色素,而成为黄色.DS从SG附近跳开,SG所 受的控制作用即被解除,玉米籽粒又变成紫色. 而DS跳到远离AC处,或者AC本身跳开,DS即不受 AC的控制,它又可以发挥对结构基因SG的抑制 作用,使玉米籽粒成为黄色.这些控制因子跳动 得如此之快,使得受它们控制的颜色基因时关 时开,于是玉米籽粒便出现了斑斑点点.
最简单的转座子不含有任何宿主基
因而常被称为插入序列(insertion sequence,IS),它们是细菌染色体或 质粒DNA的正常组成部分.一个细菌 细胞常带有少于10个IS序列.转座子 常常被定位到特定的基因中,造成该 基因突变.IS序列都是可以独立存在 的单元,带有介导自身移动的蛋白.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1983
"for her discovery of mobile genetic elements"
转座子概念
转座子(transposon,Tn) 是存在于染色体DNA上可 自主复制和移位的基本单位.
一段DNA顺序可以从原位上单独复 制或断裂下来，环化后插入另一位 点，并对其后的基因起调控作用， 此过程称转座。这段序列称跳跃基 因或转座子，可分插入序列（Is因 子），转座（Tn），转座phage。
在当时,占统治地位的染色体遗传学理论 认为,生物细胞内的遗传物质比较稳定, 遗传基因以一定的顺序在染色体上作线 性排列,彼此之间的距离也非常稳定.常 规的交换和重组只发生在等位基因之间, 并不扰乱这种距离.除了在显微镜下可见 的,发生频率极为稀少的染色体倒位和相 互易位等畸变可以改变基因的位置外,人 们还从未认识到,也难以设想出基因会从 一处跳跃到另一处.
转座因子直接从原来位置上转座插
入新的位置，并留在插入位置上， 这种转座只需转座酶的作用。 非复制转座的结果是在原来的位置 上丢失了转座因子，而在插入位置 上增加了转座因子。这可造成表型 的变化。
复合型的转座因子称为转座子(trans— poson，Tn)。这种转座因子带有同转座 无关的一些基因，它的两端就是IS，构 成了“左臂”和“右臂”。两个“臂” 可以是正向重复，也可以是反向重复。 这些两端的重复序列可以作为Tn的一部 分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转 座。
Tn两端的IS有的是完全相同的，有
的则有差别。当两端的IS完全相同 时，每一个IS都可使转座子转座； 当两端是不同的IS时，则转座子的 转座取决于其中的一个IS。
两个相邻的IS可以使处于它们中间
的DNA移动，同时也可制造出新的转 座子。Tn10的两端是两个取向相反 的IS1O，中间有抗四环素的抗性基 因(TetR)，当TnlO整合在一个环状 DNA分子中间时，就可以产生新的转 座子。
转座因子在转座期间先复制一份拷
贝，而后拷贝转座到新的位置，在 原先的位置上仍然保留原来的转座 因子。复制转座有转座酶 (transposase)和解离酶(resolvase) 的参与。转座酶作用于原来的转座 因子的末端，解离酶则作用于复制 的拷贝。TnA是复制转座的例子。
非复制转座(non-replicative transposition)
转座子插入突变克隆
1983年,美国遗传学家巴巴拉.麦克
林托克(B.McClintock)由于发现了 可移动的遗传物质,被授予诺贝尔医 学奖. 人们把B.McClintock的成就比之为 一百年前另一位伟大的遗传学家孟 德尔的成就.
转座子的发现
1951年美国冷泉港实验室的科学家 Barbara McClintock，首先发现的， 但没有被当时的其他学者所接受。
Barbara McClintock，在某些玉米籽粒 中发现了玉米色素显现着一些稀奇古怪 的模式.她观察到玉米籽粒颜色的遗传很 不稳定,有时籽粒上还出现一些斑斑点点. 她通过耐心的记录和仔细的分析,发现使 籽粒着色的色素基因是在某一特定代上" 接上"或"拉断"的.
1951年,在冷泉港生物学专题讨论会上,麦克林 托克递交了自己的学术论文,向科学界同行报 告了她的新理论.她提出遗传基因可以转移,能 从染色体的一个位置跳到另一个位置,甚至从 一条染色体跳到另一条染色体上.她把这种能 自发转移的遗传基因称为“转座因子” . “转 座因子”除了具有跳动的特性之外,还具有控 制其他基因开闭的作用,因此"转座因子"又可 叫做"控制因子". Ac/Ds转座系统
当转座子转座插人宿主DNA时，在插入处 产生正向重复序列，其过程是：先在靶 DNA插入处产生交错的切口，使靶DNA产 生两个突出的单链末端，然后转座子同 单链连接，留下的缺口补平，最后就在 转座子插入处生成了宿主DNA的正向重复。
转座因子的转座途径
复制转座
非复制转座
复制转座(replicative transposition)
Barbara McClintock USA Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY, USA 1902 - 1992
Barbara McClintock discovered the first mobile elements while doing classical genetic experiments in maize.