蛋白质一级结构测定 PPT
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蛋白质化学课件 第2章-一级结构及分析
酪蛋白 铁蛋白
质体蓝素
肽的物理化学性质
➢肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大， 而肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小， 侧链R基的差别不大。
➢等电点（两性）。
➢酸碱性质取决于：
α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离 ➢具有双缩脲(biuret)反应(H2N-CO-NH-
CO-NH2) --Pr特有的反应（与硫酸铜-氢 氧化钠溶液产生紫红色或蓝紫色颜色反 应，可用于肽和蛋白质定量测定）。
假设酶分子中含有三个异亮氨酸和两个亮氨酸，三
摩尔Ile重393.33 克，酶分子的最低相对分子质量 = 393.33 / 0.0248 = 15860 amu.
3(131-18)/2.48% = 13669 Da 2(131-18)/1.65% = 13670 Da
C 100128-9818=11036
➢20种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基 酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨 基酸在蛋白质中出现的比例，氨基酸在肽分子 中的平均分子量只有128，形成肽键时失去一 分子水（18），因此，蛋白质分子中氨基酸残 基的平均分子量为128-18=110。
（a）测得一种血红素蛋白质含铁0.426%，计 算其最低相对分子质量。 (b) 一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮 氨酸2.48%，求最低相对分子质量?
➢ 组成肽键的6个原子处于同一平面。
➢ 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋 转。
➢ 在大多数情况下，以反式结构存在。
肽键平面
一般C=N双键(0.128nm)
肽键的C及N周围三个键 角之和均为360°
6个原子处于同 一肽键平面上
两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转
两个肽键平面之间的α-碳原 子，可以作为一个旋转点 形成二面角(dihedral angle)。 二面角的变化，决定着多 肽主键在三维空间的排布 方式，是形成不同蛋白质 构象的基础。
第二章蛋白质化学蛋白质的结构(共67张PPT)
肽键为一平面
相邻的a碳原子呈反式构型
3、肽的命名及结构
• 1、根据所含AA数目：二肽、三肽、四肽等 • 2、根据来源和功能：如，脑啡肽、短杆菌肽S等。 • 3、肽结构：自然界中存在的肽有开链式结构和
环状结构。环状结构中没有游离的氨基末端和 游离的羧基末端，微生物中常见，如，短杆菌 肽S 。
4、多肽链的表达式
〔1〕组成蛋白质的多肽链数目； 2、根据来源和功能：如，脑啡肽、短杆菌肽S等。
2、亚基间呈特定的三维空间排布，依赖次级键维持其结构稳定 ．
〔2〕多肽链的氨基酸顺序； 3、蛋白质分子中亚基可相同，也可不相同。
常用的有巯基乙醇(mercaptoethanol) 、巯基乙酸(mercaptoacetic acid) 、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)等。 硼氢化锂〔LiBH4〕
2H2O
GSSG
NADP+
GSH复原酶
NADPH+H+
2. 多肽类激素及神经肽
• 体内许多激素属寡肽或多肽
• 神经肽(neuropeptide)
(三)蛋白质一级结构的测定
要求
• 样品必须是均一的。纯度在>97%以上 • 知道蛋白质的相对分子质量
• (1)组成蛋白质的多肽链数目 (2)多肽链的氨基酸种类、数目及排列顺序; (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 ★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白 质高级结构及其生物功能的根底。
化学裂解法
溴化氰法〔CNBr〕:特异性水解对Met羧基形成的 肽键 羟胺法:羟胺专一裂解Asn-Gly的肽键，酸性条件下 裂解Asn-Pro肽键。
酶水解法〔专一性高，水解产率高〕
胰蛋白酶: 胰凝乳蛋白酶〔糜蛋白酶〕: 胃蛋白酶:
蛋白质一级结构的测定
05
蛋白质一级结构测定的应用 与展望
在生物科学研究中的应用
蛋白质功能研究
通过测定蛋白质一级结构，可以 深入了解蛋白质的功能和作用机 制，为生物科学领域的基础研究 提供重要信息。
生物进化研究
蛋白质一级结构的比较分析有助 于揭示生物进化的规律和机制， 为生物进化研究提供有力支持。
生物标志物发现
蛋白质一级结构的测定可以为生 物标志物的发现和鉴定提供依据， 有助于疾病预警、诊断和治疗。
详细描述
序列分析法是测定蛋白质一级结构最直接的方法，包 括Edman降解法、化学裂解法、质谱法等。Edman 降解法是通过将蛋白质一级结构中的每个氨基酸残基 依次进行化学修饰和测序，从而确定氨基酸的排列顺 序。化学裂解法则是利用化学试剂将蛋白质分解成较 小的肽段，再测定每个肽段中氨基酸的组成和排列顺 序。质谱法则通过分析蛋白质的离子化特性来确定氨 基酸序列。
质谱技术的优势与局限性
优势
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高 准确性等优点，能够快速准确地测定蛋 白质一级结构，且样品需求量少，适用 于大规模蛋白质组学研究。
VS
局限性
质谱技术对于样品纯度和分子量范围有一 定的要求，对于复杂样品和低丰度蛋白质 的测定仍存在挑战。同时，质谱仪器成本 较高，操作和维护较为复杂。
肽质量指纹图谱
通过将蛋白质酶解成肽段，利用质谱技术分析肽段的质量， 可以获得肽质量指纹图谱，用于蛋白质的鉴定和一级结构 的测定。
串联质谱
串联质谱技术通过将肽段离子进一步裂解，产生更小的片 段离子，从而更精确地测定肽段序列和氨基酸组成，进一 步确定蛋白质一级结构。
磷酸化位点测定
质谱技术还可以用于磷酸化位点的测定，通过分析磷酸化 肽段的离子，可以确定磷酸化位点和磷酸化类型。
第三章蛋白质一级结构的测定
其中最重要的是多肽链的
氨基酸顺序，它是蛋白质生
物功能的基础。
包括以下几方面内容：
①多肽链的数目；
②每条多肽链中氨基
酸的种类、残基数目和
排列次序；
③链内或链间二硫键
的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
裂解后肽段的分离纯化方便
选择裂解试剂困难
2. 测定一级结构的准备工作
对样品纯度的要求
对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
类
蛋白质的氨基酸组成
蛋白质的配基
蛋白质的端基分析
样品必需纯（>97%以上）
……
常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：
①双向分析电泳；
②在解离条件下的凝胶电泳；
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
非极性R基团氨基酸
O
H
H 32NN＋
CH
C
CH
CH
CH
O－
OH
3
3
-氨基异戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
亮氨酸
Leucine
非极性R基团氨基酸
O
HH3N2 N＋
CH
CH
2
CH
CH
O
＋
HH3N
2N
CH
CH
C
OH
氨基酸顺序，它是蛋白质生
物功能的基础。
包括以下几方面内容：
①多肽链的数目；
②每条多肽链中氨基
酸的种类、残基数目和
排列次序；
③链内或链间二硫键
的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
裂解后肽段的分离纯化方便
选择裂解试剂困难
2. 测定一级结构的准备工作
对样品纯度的要求
对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
类
蛋白质的氨基酸组成
蛋白质的配基
蛋白质的端基分析
样品必需纯（>97%以上）
……
常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：
①双向分析电泳；
②在解离条件下的凝胶电泳；
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
非极性R基团氨基酸
O
H
H 32NN＋
CH
C
CH
CH
CH
O－
OH
3
3
-氨基异戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
缬氨酸
Valine
亮氨酸
Leucine
非极性R基团氨基酸
O
HH3N2 N＋
CH
CH
2
CH
CH
O
＋
HH3N
2N
CH
CH
C
OH
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H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
高丝氨酸内酯
+ H3N+
RO CH C
（2）多肽链的末端氨基酸测定
N末端的测定
二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）；
C末端的测定
羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法
N末端的测定
N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确，主要的 方法有：
采用经典的阳离子交 换色谱分离、茚三酮 柱后衍生法，对蛋白 质水解液及各种游离 氨基酸的组分含量进 行分析。
②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分 子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
③二硫健的断裂及多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分 离出来；
蛋白质一级结构测定
蛋白质氨基酸顺序的 测定是蛋白质化学研究 的基础。
自从1953年F.Sanger 测定了胰岛素的一级结 构以来，现在已经有上 千种不同蛋白质的一级 结构被测定。
蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
（1）测定蛋白质的一级结构的要求
A. 样品必需纯（>97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键 还原为巯基；
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试 剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；
如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。
二硝基氟苯法（DNFB法）
肽链N末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成二 硝基苯的衍生物（DNP-肽），其经酸水解后生成的DNP-氨 基酸可用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提，再与其他氨基酸分 开，鉴定得知N末端的氨基酸。
胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮 氨酸、以及其他疏水性强
胰蛋白酶（trypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
• 特点：专一性较强，水解速度快 • 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 • R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） • R2=Pro（抑制）
嗜热菌蛋白酶（thermolysin)
➢ 特点：专一性较差 ➢ 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏
水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 • R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、
Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA 水解速度较快
④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺 序的测定
用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱 水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析 仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反 应分析各肽段氨基酸顺序；
⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解
获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重 叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序； 确定多肽链中二硫键的位置。
糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
水解位点
R4 肽链
• 特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢 • 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基
酸残基的羧基端肽键 • R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA • R2=Pro（抑制）
溴化氰水解法(Cyanogen bromide)
---选择性地切割由Met羧基形成的肽键
ห้องสมุดไป่ตู้
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
+
NH CH C NH CH C
2、多肽链氨基酸顺序分析
• 多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法
酶解法
某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的 某一类肽键；
主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热 菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；
糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；
计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
（2）蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位
①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨 基酸的数量；
➢ 木瓜蛋白酶：
专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
➢ 葡萄球菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键
——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）
➢ 梭菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键
化学法
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
胃蛋白酶 Pepsin
• 特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； • 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 • R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、
Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 • R1=Pro（抑制） • pH2.0
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
★巯基的保护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
C H2O C C l
-OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
NH3+
O
-OOC CHCH2 SCH2
O
NH3+
ICH2CNH2
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化