苯酚硫酸法测葡萄糖
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蔥酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品屮的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馆装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馅水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馆水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸憎水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶屮避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤0123456AvV丨• ■ •葡萄糖0. 00. 10. 20. 30.40. 60. 8 1.0苯酚液0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5浓硫酸 3. 0 3. 0 3. 0 3. 0 3.0 3. 0 3. 0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n,取出凉水冷却lOmin,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馅水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚-硫酸法快速测定多糖方法的优化
1.2.3 单因素试验设计以100μg/mL 葡萄糖标准溶液200μL 为研究对象，酶标仪检测波长为490nm 时的OD 值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD 490nm 值的影响[6]。
1.2.4 正交优化试验在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD 490nm 值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。
表1 正交试验因素水平表2200700803300800901.2.5 标准曲线制作以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL 、浓硫酸700μL 后，迅速摇匀，80℃水浴10min 后，冷水浴5min 终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL ，采用酶标仪在490nm 波长下测定OD 值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD 490nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD 490nm 值，并根据标准曲线计算多糖含量。
2 结果与分析2.1 酶标仪检测波长的确定采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm 处有最大吸收峰，故可选择490nm 作为酶标仪检测波长。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量 标准作业指导书
产品质量胞外多糖的测定
1目的
依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。
2适用范围
本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。
本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定
本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。
3参考文件
无
4定义
胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS):是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。
5职责
5.1测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。
5.2测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。
5.3测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。
6程序
6.1试剂和材料
表1准备试剂和材料清单
表2混合材料和溶液配置清单
6.2仪器设备
表3仪器设备清单
6.3操作流程表
表4胞外多糖的测定操作流程表
6.4具体操作流程
表5胞外多糖的测定具体操作
7附件
附件1《实验室测试报告》。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚_硫酸法测定葡萄酒中总糖含量的样品处理_刘志明
总糖的测定：苯酚硫酸法
总糖的测定：苯酚硫酸法2008-12-06 22:38:00 作者：来源：互联网浏览次数：758 文字大小：【大】【中】【小】苯酚-硫酸法测定总糖[原理]多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
[试剂]1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸[操作]1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5. 0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
葡萄糖标准曲线
硫酸－苯酚法测定多糖含量标准曲线实验1、葡萄糖标准液（0.1mg/mL）:精密称取无水葡萄糖10 mg，用蒸馏水定容到100mL，混匀。
2、5%苯酚：精密称取重结晶苯酚10 g，用蒸馏水定容到200mL，混匀棕色瓶保存。
硫酸－蒽酮法测定多糖含量标准曲线实验1、葡萄糖标准液（0.1mg/mL）:精密称取无水葡萄糖10 mg，用蒸馏水定容到100mL，混匀。
2、蒽酮试剂：称取蒽酮0.2g，用浓H2SO4定容到100mL，混匀。
临用时现配。
3、苯酚－硫酸法测定葡萄糖标准曲线4、试剂：5、1、标准G（0.1mg/mL）:精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖10 mg，加水定容到100mL。
6、2、5%苯酚：精确称取10重结晶苯酚5g，加水定容到100mL7、8、10、1、芦丁对照品溶液精密称取1 2 0℃干燥至恒重的芦丁20m g，加入60 %乙醇（提取剂浓度一至）溶解，定容至1 0 0 ml 容量瓶中，摇匀，制成0 .2 m g /ml 的芦丁对照品溶液。
11、12、13、多酚测定14、 1.1.3 试剂及溶液没食子酸、酒石酸钾钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、石油醚、乙醇等均为国产分析纯。
本试验用水均为双蒸水。
15、各种溶液的配制：16、（1）没食子酸母液：精确称取没食子酸500 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 mL作为母液，分别吸取2.5、17、5、7.5、10、12.5、15 mL于25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制备成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mg/mL的标准液。
18、（2）pH 7.5磷酸缓冲液1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液（A液）：称取磷酸氢二钠（GB1263）23.877 g，加水溶解并定容至1 L。
1/15 mol/L 的磷酸二氢钾溶液（B 液）：称取经110℃烘干2 h的磷酸二氢钾（GB1274）9.073 g，加水溶解并定容至1 L。
19、取A液85 mL和B液15 mL混匀，即得pH 7.5的缓冲液。
苯酚-硫酸法测多糖含量
苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1. 目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤AvV 口吕号0 1 2 3 4 5 6葡萄糖0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表 2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n, 取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用 exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
糖含量测定-苯酚硫酸法
1．1原理
多糖可以被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处和一定浓度范围内，其吸光度值与糖含量呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
1．2实验步骤
1．2．1100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液制备
精密称取10mg D-葡萄糖，加纯化水充分溶解，定容至100ml，作为对照品溶液。
1．2．26%苯酚溶液配制
称取6g苯酚，加入纯化水充分溶解，定容至100ml，备用。
1．2．3对照品管制备
取8支试管，按下表按下表加入100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液：
1．2．4供试品管制备
将供试品采用纯化水稀释至D-葡萄糖标准曲线范围内，每步稀释应不超过10倍。
10倍及以内的稀释直接在玻璃试管中进行。
10倍稀释用移液器量取供试品100μl，加纯化水900μl，振荡混匀。
原倍稀释直接取供试品1.0ml加入玻璃试管中。
10倍以内稀释操作按下表在试管中加入相应溶液。
大于10倍的稀释需按下表操作在离心管中先做10倍或100倍稀释（2步10倍稀释）后，再在玻璃试管中按照下表量取稀释。
更高稀释倍数也按照上述原则进行。
1．2．5试验操作
向含有1ml标对照品和供试品的试管中加入0.6ml 6%苯酚溶液，混匀，迅速加入3ml浓硫酸，混匀，置沸水浴反应20分钟。
显色后，冷却至室温，依据紫外-可见分光光度计标准操。
硫酸苯酚法测多糖含量
硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量，如1型。
2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存可达半年。
3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6. 实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
苯酚-浓硫酸
苯酚—浓硫酸法测糖含量原理是糖样品在浓硫酸作用下，迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合反应，显橙黄色，在波长490 nm处和一定浓度范围内，其吸光度和糖浓度呈线性关系用比色法与葡萄糖标准系列比较进行定量分析。
①标准曲线的测定
取100 mg，用蒸馏水定容至1000 mL，得到浓度为0.01%的葡萄糖标准溶滚。
分别稀释2，4，5，8倍，各取2.0 mL分别置于试管内，再向各试管中加入1.0 mL 0.6%的苯酚溶液，振荡再加入5.0 mL浓硫酸，迅速振荡摇匀，放在室温下反应15至20分钟。
另取2ml蒸馏水，同上操作加苯酚和浓硫酸进行显色反应，作为空白对照。
分别于490 nm处测定以上溶液的吸光度值，以葡萄糖的浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。
图5 糖浓度标准曲线
②苯酚—浓硫酸法测定发酵液中含糖量
反应液为2.0 mL发酵液（按具体情况稀释一定倍数），1.0 mL 0.6%苯酚溶液，5.0 mL浓硫酸，在沸水中反应15至20分钟后，冷却，在490 nm处测定吸光度。
并根据标准曲线求出糖浓度，以时间为横坐标，以糖浓度为纵坐标作图。
葡萄糖标准曲线苯酚硫酸
葡萄糖标准曲线苯酚硫酸葡萄糖标准曲线苯酚硫酸是一种常用的生化试剂，用于测定血液或尿液中的葡萄糖含量。
它是一种间接测定法，利用葡萄糖在酸性条件下与苯酚和硫酸反应生成蓝色产物，通过比色法测定其光密度来确定葡萄糖含量。
本文将介绍葡萄糖标准曲线苯酚硫酸的原理、操作步骤和注意事项。
原理。
葡萄糖在酸性条件下与苯酚和硫酸反应生成蓝色产物，其光密度与葡萄糖的浓度成正比。
在测定葡萄糖含量时，首先需要制备葡萄糖标准曲线。
将一系列已知浓度的葡萄糖溶液与苯酚硫酸试剂按一定比例混合，然后测定其光密度，得到一条葡萄糖浓度与光密度的标准曲线。
待测样品的葡萄糖含量可以通过测定其光密度并与标准曲线对照得出。
操作步骤。
1. 准备试剂，将苯酚硫酸试剂配置好，按照配比将苯酚溶液和浓硫酸混合制备成试剂。
2. 制备葡萄糖标准曲线，取一系列已知浓度的葡萄糖溶液，分别加入苯酚硫酸试剂，混合均匀后，测定其光密度，绘制葡萄糖浓度与光密度的标准曲线。
3. 测定待测样品，取待测样品，加入苯酚硫酸试剂，混合均匀后，测定其光密度，通过葡萄糖标准曲线计算出其葡萄糖含量。
注意事项。
1. 操作中应注意安全，避免接触浓硫酸和苯酚。
2. 制备葡萄糖标准曲线时，应严格按照已知浓度的葡萄糖溶液配制，保证溶液浓度的准确性。
3. 测定待测样品时，应保证样品与试剂充分混合，避免气泡和悬浮物影响测定结果。
4. 仪器的使用和光密度的测定应按照操作手册进行，确保测定结果的准确性。
总结。
葡萄糖标准曲线苯酚硫酸是一种常用的生化试剂，通过间接测定法可以准确测定血液或尿液中的葡萄糖含量。
在使用过程中，需要严格按照操作步骤进行，注意安全，保证试剂和样品的准确性，以获得可靠的测定结果。
希望本文能够对您的实验工作有所帮助。
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苯酚硫酸法
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂
1．浓硫酸：分析纯，95.5%
2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）
4．标准葡聚糖。
操作
制作标准曲线：
准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
注意:
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
光密度值最好在0.1——0.3之间。
比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。