细胞复苏传代冻存过程
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
293细胞复苏传代冻存
复苏293细胞
1.紫外消毒超净台，完全培养基（10％FBS）复温，准备一个15ml离心管；
2.从液氮（-198℃）中取出293细胞，在37℃水浴锅解冻；
3.取10ml完全培养基于15ml离心管，加1.5ml冻存293细胞，轻轻混匀；
4.离心1500rpm，3min；
5.吸走上清，混匀后加5ml完全培养基；
6.吹打混匀后转入培养瓶培养。
293细胞传代
1.293细胞长到70％即可传代，将培养皿边缘用酒精棉球擦一遍；
2.负压吸走培养基，加PBS 洗一遍；
3.负压吸走PBS，加胰酶（没过皿底即可）消化；
4.负压吸走胰酶，加两吸管培养基，将细胞从皿底吹落；
5.对准皿底用力吹打10下，将细胞吹散；
6.将吹散细胞加入培养基内，摇匀；
7.种细胞，6孔板每孔加2ml（用于转染的板需先用Polylysine扩板），放回孵
箱培养。
冻存293细胞
1.当293细胞长到70％时，准备冻存；
2.冻存液：90％完全培养基，10％DMSO （根据说明书要求配制，不同种类
293冻存液不同）；
3.吸干培养基，用PBS洗一遍；
4.加入胰酶消化后，吸去胰酶，加入少许培养基吹打；
5.转入15ml离心管，加培养基至10ml并混匀；
6.离心1500rpm，3min；
7.吸去上清，沉淀加冻存液吹打混匀（根据要冻存的细胞的多少加适当量的冻
存液，冻存细胞浓度不宜过稀，一个25cm2培养瓶冻2-3管）；
8.分装至冻存管，每管约1.5ml；
9.将冻存管放入异丙醇盒并置于-80℃过夜;
10.然后将冻存管放入液氮储存。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
RD细胞复苏、传代、冻存
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。
在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。
第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。
2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25 瓶为类；1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。
加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。
记录冻存管位置以便下次拿取。
细胞传代冻存复苏步骤
准备处事：之阳早格格创做1、加进细胞室前，最先用75%酒粗揩试处事台，交着紫中灭菌30-50min，过后，关关紫中灯，透气10min.2、从冰箱中与出胰酶、PBS缓冲液、培植基注意事项：1、所有真验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘搞.2、挨开溶剂，培植瓶瓶盖时，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下.3、用完溶剂，培植瓶时，瓶心及瓶盖也要正在酒粗灯上烤一下.开初处事：1、真验前易服帽，开风淋，吹风.2、75%乙醇揩脚，而后用75%乙醇揩一下台里，面焚酒粗灯.3、与待用的细胞，旋紧瓶盖.4、弃去旧的培植液，把培植瓶搁回本处.5、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.而后将PBS缓冲液弃掉.7、用移液管（微量枪）吸与适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头.8、将细胞置于5%CO2、37度培植箱中1min-2min，脚段：普及酶活性，促进消化.9、与待用细胞，与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.10、用移液管加进适量的真足培植液浑洗（吹集细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹集下去，再将细胞悬液移进的离心管中，启心，标签.11、离心5min，1000转/min.以下分别介绍：一换液1、与待用的细胞，旋紧瓶盖.2、弃去旧的培植液，把培植瓶搁回本处.3、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.而后将PBS缓冲液弃掉.5、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.6、用移液管加进适量的细胞培植液于培植瓶中.7、将细胞置于5%CO2、37度培植箱培植.两传代1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液，吸与已配造的培植基适量，加进离心管中，将细胞沉悬、吹匀.2、与4-6滴细胞悬液到新的培植瓶中，培植瓶中应先加佳适量细胞培植液，吹集细胞，镜下瞅察，细胞稀度相宜则置进5%CO2、37度细胞培植箱中.三冻存1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液.2、按胎牛血浑：DMSO=9:1的比率配造冻存液，拆进青霉素瓶中.3、用移液管将冻存液仄衡加进离心管中，混匀离心管中细胞冻存液.4、用移液管将含细胞的冻存液移进冻存管中，启心，标签.5、冻存，需缓缓冻存，先搁置4度冰箱1小时，而后搁置-20度冰箱2小时，再置于-80度冰箱过夜，终尾置于液氮灌中保存.四种板1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液.2、与培植瓶及小烧杯各一只，摆搁佳.3、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.4、先移与2ml，5ml，20ml真足培植液,分别加进到离心管，培植瓶，小烧杯中.5、混匀离心管中含真足培植液的细胞，再从离心管中与适量细胞悬液移进培植瓶，吹集细胞.镜下瞅察，细胞稀度相宜则置进5%CO2、37度细胞培植箱中.（细胞传代脚段）6、与细胞计数板，盖玻片酒粗揩拭，均正在酒粗灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中与出细胞悬液（约10μl），弃掉枪头，滴进盖玻片下（没有克没有及有气泡，可则会做用细胞计数），镜下瞅察细胞数（每个象限5个细胞，总战20个细胞，5×104个），没有竭安排小烧杯中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下瞅察细胞数目切合央供.7、与1个96孔板，用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周，孔板盖正在酒粗灯上烤一下.8、用微量枪从小烧杯中与出细胞悬液（约100μl），依次滴进96孔板中（枪头至孔下1/3处），共时用移液枪吸与真足培植液（约100μl）动做对付照或者调整，边沿孔用无菌PBS弥补.9、滴完后，仍用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周.10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培植箱中举止培植.五 MTT真验1、交种细胞：用含10％胎牛血浑的培植液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞交种到96孔板，每孔体积100μl.2、称与3mg MTT粉终，加6ml真足培植液，配造成浓度5%的MTT溶液，的微孔滤膜除菌.3、培植细胞：共普遍培植条件，培植3－5天（可根据考查脚段战央供决断培植时间）.4、培植3－5天后，与出96孔板，用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周，孔板盖正在酒粗灯上烤一下.5、用（120μl）移液枪留神吸弃孔内培植上浑液（包罗调整孔内的培植上浑液），弃去枪头.再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包罗调整孔，但是边沿孔除中（枪头正在孔上1/3处）.6、呈色：继承孵育4小时，终止培植，留神吸弃孔内培植上浑液，对付于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培植上浑液.每孔加150μl DMSO，置摇床上振荡10分钟，使结晶物充分融解.7、比色：采用490nm波少，正在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸支值，记录截止，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标画造细胞死少直线.六复苏1、准备处事：开开恒温火浴锅，将温度安排正在37℃，与一离心管，加进5ml细胞培植基.2、与出冻存管，坐时搁进火浴锅中赶快摇摆，让冻存液赶快融化.3、用酒粗棉球揩洗冻存管中部以落矮传染机会.4、挨开冻存管，将冻存液留神变化到预先加进有培植基的离心管中，800rpm离心5分钟.5、留神弃掉上浑，加进约5ml培植基沉悬细胞.6、将所得细胞悬液变化进培植瓶中，盖上瓶塞，置培植箱培植.换液，传代真验用材：牛奶瓶2个---PBS缓冲液，DMEM培植基血浑瓶1个---胰蛋黑酶换液：移液管2个传代：培植瓶1个，移液管3个，离心管1个MTT真验用材：试剂：MTT粉，PBS缓冲液，真足培植液，两甲亚砜（DMSO）器材：96孔板，移液管，移液枪，烧杯，青霉素瓶若搞，小滤器，微孔滤膜除菌，酶联免疫检测仪.浑单：牛奶瓶1个，血浑瓶2个，培植瓶3个，移液管5个，离心管2-3个.。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤细胞的传代冻存技术是生物医学研究中的一个重要方式。
该技术可以将细胞批量保存并长期维持其活性，以便进行进一步的研究。
细胞传代冻存的过程可以简单地概括为以下几个步骤：从培养皿中收集细胞，处理和停滞细胞增殖，添加冻存保护剂，将细胞悬液冷冻存储，最后进行复苏。
下面我们就详细描述一下这个具体步骤：1. 收集细胞收集细胞需要注意细胞的龄期，通常在细胞的对数生长期收集更好。
另外要注意细胞的数量不能过少或过多。
2. 停滞细胞增殖为了将细胞传代，减少增值周期并停滞细胞增殖是必要的。
对于一些高度增殖性的细胞，可以通过干预细胞内基因表达、添加生长因子等方式来实现。
一般可以使用过量的培养基，并将细胞保存在低吸附的容器中来停滞细胞增殖。
这样可以防止细胞形成多层，而保证单层生长。
3. 添加冻存保护剂添加冻存保护剂是细胞传代冻存的关键步骤之一。
冻存保护剂可以有效地保护细胞免受冻结脱水、冰晶形成和低温应力等因素的损害。
最常用的冻存保护剂是一些有机溶剂，例如DMSO（二甲基亚砜）、甘油等。
这些保护剂可以在细胞冷冻存储的过程中降低溶液的结冰点，防止冰晶的形成。
4. 冷冻存储在添加了冻存保护剂后，可以将细胞悬液装入冷冻管中，使用缓慢冷冻和液氮快速冷冻两种方法将细胞冷冻存储；液氮快速冷冻的方式冷冻效率高，但是会对细胞产生更大的应激，可能会降低细胞的复苏率。
缓慢冷冻是比较安全的方式，可以使用-80度的冰箱进行冷冻，时间从数小时到数日不等。
5. 复苏细胞冻存后，想要复苏它们，需要将细胞迅速退回到正常培养条件下。
此时需要谨慎地处理，以免破坏细胞结构和细胞膜等。
复苏的过程需要按照以下步骤：- 缓慢加热：将冻存细胞悬液从液氮中取出，快速将冻存管放入37度的水浴中，缓慢加热，让细胞悬浮在解冻液中的DMSO等有机溶剂逐渐被稀释。
- 洗涤：用无血清的培养基或PBS等洗涤一遍细胞，约10分钟，以去除有机溶剂。
- 均匀吸附：将无血清培养基或PBS加入细胞悬液中，让细胞吸附于培养皿上，约30分钟。
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存
步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存细胞复苏、传代及冻存实验步骤:一复苏传代（ 1）准备无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔（2）步骤1穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。
2 解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。
3 开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。
4 加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。
5平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
6培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。
7有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。
一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。
8细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。
9加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。
10加入4ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。
11转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至4ml。
12小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
悬浮细胞复苏传代冻存详细步骤
THP1细胞复苏传代以及冻存步骤
一,复苏
1,将液氮中冻存细胞拿出，迅速放在37℃水浴锅1-2min至融化。
2,1640培养液提前放入37℃,用1640培养基6ml左右洗涤一次，注意吹打使细胞分散，然后300g（rcf）5min离心（活细胞最大1400g）3,弃掉上清，用6ml左右培养基重悬。
4,加入到T25培养瓶，镜下观察细胞状态。
5,悬浮细胞竖立放入温箱。
二，传代（传代两次以上再用于后续实验）
1,镜下观察细胞密度，计数板计数，确定稀释倍数。
2,300g（rcf）5min离心，去除培养液。
3,加入适量预热的培养基，制成10^5个细胞/ml 的细胞悬液。
4,分装到2-3个新培养基，将其放入培养箱，24h观察一次（变黄了就传一次，2d左右）
三,冻存细胞
1，离心弃上清，用冻存液（领商品化试剂或者领血清，DMSO等配制），1ml左右混匀，注意避免气泡。
2,商品化的先放进-80℃，4h左右，再放入液氮罐，自己配制的要缓冻，先将-80℃盒子拿出来平衡，然后放入-80℃过夜，然后放液氮，或者在4℃，-20℃，-80℃依次放4h，然后转入液氮。
细胞冻存、复苏和传代
细胞冻存1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时冻存为佳。
2.准备：胰酶、培养基、PBS、胎牛血清、DMSO、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。
3.弃细胞瓶中培养基。
1ml PBS洗一次，弃PBS。
加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。
4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。
用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。
5.1200rpm下室温离心5分钟。
在此期间，将胎牛血清滤菌处理后，按DMSO:FBS=1:9的比例配置冻存液。
6.离心后弃上清，加入1ml冻存液。
细胞重悬后加入冻存管，冻存管置入冻存盒，置于-80℃下保存。
细胞复苏1.水浴锅预热至37℃。
-80℃冰箱中取出冻存细胞，37℃水浴下快速融化（1分钟左右为宜）。
2.准备：培养基、1ml灭菌枪头、25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。
3.吸取细胞悬液至15ml离心管中。
1200rpm下室温离心5分钟。
期间，新的25T细胞瓶中加入4ml培养基。
4.弃上清，尽量吸干净，加入1ml培养基重悬，直接加入至25T细胞瓶，晃匀后送入培养箱进行培养。
细胞传代1.取出培养箱中的细胞瓶，镜下观察细胞生长状况，至细胞密度90%时传代为佳。
2.准备：胰酶、培养基、PBS、1ml灭菌枪头、200μl灭菌枪头，25T细胞瓶或六孔板等，与细胞瓶一同经酒精喷雾消毒后置入超净台。
3.弃细胞瓶中培养基。
1ml PBS洗一次，弃PBS。
加入1ml胰酶，摇晃均匀，37℃下消化。
4.镜下观察消化完全后，加入等量培养基终止消化。
用移液管取瓶中液体冲洗后壁，使未脱落的细胞冲至瓶底，随后吸取液体至15ml干净的离心管中，标记离心管。
5.1200rpm下室温离心5分钟。
每25T细胞瓶加入4ml培养基，其余据面积依次换算。
6.离心后弃上清，加1ml培养基重悬，根据经验于25T细胞瓶（或六孔板）中加入适量重悬细胞液。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤1.细胞培养首先，需要从细胞库中取出要冻存的细胞，并将其接种在适当的培养基上。
培养基应该包含适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的正常生长和分裂。
2.细胞生长将培养皿置于恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和气体环境。
细胞需要在培养基中适当的时间内生长和扩增。
通常，培养时间为2-3天，视细胞类型而定。
3.细胞检查在细胞生长期间，必须定期对细胞进行检查，以确保其健康和无污染。
细胞检查可通过显微镜观察细胞形态和活力，或通过细胞培养基中的染料检测细胞活性。
4.细胞分离一旦细胞达到所需的数量，即可进行细胞分离。
使用适当的胰蛋白酶或其他消化酶来分离细胞。
细胞分离后，将其转移至新的培养皿中。
5.细胞计数使用血细胞计数板或其他形式的计数器来计数细胞数目。
细胞计数是决定细胞数量和密度的重要步骤，以确保在冻存过程中使用适当的细胞浓度。
6.冻存液制备冻存液是保护细胞冻存过程中的关键溶液。
常见的冻存液成分包括培养基和甘油、DMSO（二甲基亚砜）等保护剂。
这些成分具有保护细胞免受冻结和解冻过程中的损伤的作用。
7.细胞冻存将细胞和冻存液混合在一起，使用冷冻管或冻存管将其分装。
然后将冻存管放入冷冻容器中，使其逐渐冷却至极低温（通常为-80℃或液氮温度）。
8.细胞解冻在需要复苏细胞时，从冷冻容器中取出冻存管，快速解冻至37℃。
解冻时应非常小心，以免损伤或破坏细胞。
可选择将冻存管置于37℃水浴中解冻，或使用预先加热的介质进行解冻。
9.细胞复苏一旦细胞完全解冻，将其迅速转移到预先准备好的培养皿中。
加入适量的培养基和生长因子，为细胞提供所需的营养和环境条件。
将培养皿放入恒温培养箱中，并维持适当的生长条件。
10.细胞生长观察在细胞复苏后，定期观察细胞的生长和活性。
使用显微镜观察细胞形态和增殖情况，确保细胞正常生长。
如果发现任何细胞死亡或异常现象，可能需要采取相应的措施来解决。
11.细胞传代一旦细胞复苏并正常生长，可以进行细胞传代以扩增细胞数量。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞传代冻存复苏步骤
准备工作：1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台,接着紫外灭菌30—50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。
2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基注意事项:1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒,烘干.2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
开始工作：1、实验前换衣帽,开风淋，吹风。
2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
5、取移液管一支,塞棉花端，及管身,均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。
7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。
8、将细胞置于5％CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性,促进消化。
9、取待用细胞,取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中,封口，标签.11、离心5min，1000转/min。
以下分别介绍:一换液1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
3、取移液管一支，塞棉花端,及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球.4、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。
5、取移液管一支,塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下,套好吸球。
6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。
7、将细胞置于5％CO2、37度培养箱培养。
二传代1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量,加入离心管中，将细胞重悬、吹匀.2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞,镜下观察，细胞密度适宜则置入5％CO2、37度细胞培养箱中。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
简述动物细胞培养过程中细胞复苏传代冷冻的操作方法
简述动物细胞培养过程中细胞复苏传代冷冻的操作方法动物细胞培养是研究和应用生物学领域中非常常见的技术手段。
在细胞培养过程中，细胞复苏、传代和冷冻是非常重要的操作步骤，下面将对这三个步骤进行详细的描述。
1.细胞复苏：细胞复苏是指从冷冻的细胞样品中恢复活性的过程。
细胞冷冻保存是为了长期保存和传递细胞系。
细胞复苏的基本流程如下：a.准备培养基：首先需要准备适合细胞类型的培养基，培养基中应含有必需的营养物质和生长因子，以促进细胞的复苏。
b.解冻冷冻细胞：将冷冻的细胞样品快速解冻，并迅速将其转移到预热的培养基中。
解冻过程需要非常迅速，以避免细胞受到冻结引起的损伤。
c.细胞培养：将解冻的细胞转移到预先涂覆有培养基的培养皿中，并放置在恒温培养箱中进行培养。
在培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和增殖情况，以确定细胞是否成功复苏。
2.细胞传代：细胞传代是指将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中继续培养的过程。
细胞传代的主要目的是扩大细胞数量，以满足后续实验的需要。
细胞传代的基本流程如下：a.细胞解聚：在细胞的解聚过程中，常用的方法是使用酶类（如胰蛋白酶）对细胞进行消化，以将细胞从培养皿表面解离下来。
b.细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
细胞密度的控制非常重要，过高或过低都会影响细胞的生长和增殖。
c.接种细胞：根据细胞密度的要求，将细胞解聚后的适量细胞转移到新的培养皿中，加入适量的培养基，并轻轻摇晃培养皿以均匀分布细胞。
d.细胞培养：将接种过的细胞培养皿放置在恒温培养箱中进行培养。
在培养的过程中，同样需要定期观察细胞的形态和增殖情况，以控制细胞的状态和密度。
3.细胞冷冻：细胞冷冻是为了长期保存和传递细胞系而进行的操作步骤。
细胞冷冻的基本流程如下：a.细胞准备：选择处于良好状态的细胞进行冷冻。
此时，细胞应处于对冻结过程耐受的阶段，生长状态良好。
b.细胞解聚：将细胞从培养皿表面解离下来，常用的方法是使用酶类对细胞进行消化。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。
4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。
3.离心，1 000 rpm，5 min。
4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液，继续培养。
四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。
一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
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一、细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正)
进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-3０分钟。
紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
１、细胞培养液的配制:
配制50mｌ培养液(45mｌ基础培养液＋5ml的胎牛血清+５０0ｕｌ的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加)
2、细胞复苏:
将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1mｉｎ。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15mｌ离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,１０00rpm, 3分钟。
然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T２５的培养瓶中加入4mｌ配好的培养基,然后用１ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T２5瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将Ｔ２５取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上7５%的乙醇,放入３7℃ 5%CO2的孵箱内。
(将细胞冻存管从液氮或者－8０℃取出后迅速置于3７℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心３分钟。
弃掉上清,然后加入１mｌ配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内,再加入４ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T ２5取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CO2的孵箱内。
)
3、细胞换液:
复苏的细胞在３7℃ 5％CO2的孵箱内孵育4-６个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。
贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗1-2次,每次3－5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入５mｌ新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CＯ２的孵箱内。
悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ｍｌ无菌的大枪头将培养液小心的转移至１5ml无菌的离心管中,1000rpｍ,3分钟去上清,加入1ｍｌ配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T2５的培养瓶中加入4ｍｌ配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶
内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
4、细胞传代:
当细胞生长到８0%-90％时,其的生长状态与细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞传代了。
贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗１-２次,每次3-５ｍl,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PＢS,小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化,放入孵箱,1-2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上75％的乙醇,拿到超
净台里,加入2ml培养基终止消化,用1mｌ无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打,尽量使更多的细胞掉下来,吹打数次后转入１5ｍl无菌的离心管,100０rpm,3分钟,然后弃去上清,一般细胞的传代比例为1传2或者1传３,如果要就是1传2就用２ml新鲜培养基重悬,分别将重悬好的细胞分到２个T2５瓶内,然后各取４mｌ新鲜培养基补齐。
如果就是1传3就用３ml新鲜培养基重悬,分别将重悬好的细胞分到3个T25瓶内,然后各取4ml新鲜培养基补齐。
喷上75%的乙醇,放入37℃５%CＯ2的孵箱内。
悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml无菌的离心管中,１０00ｒpm,３分钟去上清,加入2ml或者３ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬,分别将重悬好的细胞分到2个或３个T２５瓶内,然后各取4ml新鲜培养基补齐,喷上７5%的乙醇,放入37℃5％CO2的孵箱内。
5、细胞冻存
当细胞生长到8０％-90％时,其的生长状态与细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞冻存了。
先按胎牛血清与二甲基亚砜(DＭＳＯ)为９:1的比例配细胞冻存液。
贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的P ＢS冲洗1－2次,每次3－5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的ＰBＳ,小心的用1ml无菌的大枪头加入1ｍl0、25％胰酶消化,放入孵箱,１－2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上７５％的乙醇,拿到超净台里,加入２ｍl培养基终止消化,用1mｌ无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打,尽量使更多的细胞掉下来,吹打数次后转入１5ml无菌的离心管,100０rpm,３分钟,然后弃去上清,一般细胞的冻存比例为1冻1或者1冻2,如果要就是1传1就用1ｍl新鲜配制的细胞冻存液重悬,将重悬好的细胞转移至准备好无菌的细胞冻存管内,然后用封口膜与美仑纸将瓶口包好。
如果就是1传２就用２ml新鲜配制的细胞冻存液重悬,分别将重悬好的细胞分到2个准备好无菌的细胞冻存管内,然后用封口膜与美仑纸将瓶口包好。
4℃ 30分钟,-20℃ 1小时,-80℃过夜然后转入液氮保存。
悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ｍｌ无菌的离心管中,10００ｒpm,3分钟去上清,加入1ｍl或者２ml新鲜配制的细胞冻存液使沉淀的细胞重悬,分别将重悬好的细胞转移至到1个或2个准备好无菌的细胞冻存管内,然后用封口膜与美仑纸将瓶口包好。
４℃３0分钟,-20℃ 1小时,-8０℃过夜然后转入液氮保存。