蛹虫草培养基残余体综合利用的研究进展

dible蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬虫夏草、北虫草，与冬虫夏草同属异种。

由于其主要药用成分虫草素含量比冬虫夏草高得多，大约为后者3~5倍甚至10倍[1]，且蛹虫草更容易人工栽培，因此蛹虫草目前被选为冬虫夏草的最佳替代品。

我国蛹虫草子实体的生产已有相当规模，在子实体收获后产生大量废弃的培养基残余体作为废弃物被扔掉。

这不仅污染环境而且造成很大浪费。

废弃的培养基中含有丰富的菌丝体，其中还有大量的虫草素和腺苷及多糖类等活性物质[2]。

如何利用好虫草培养基残余体不仅能提高蛹虫草生产的附加值，也能解决环保问题，具有重要的经济效益和生态效益。

因此，近年来虫草培养基残余体的综合利用研究备受关注。

笔者从虫草培养基残余体的虫草素、虫草多糖的提取纯化，在保健食品和饲料中的应用及作为杀虫真菌制剂或用于培养其它微生物等方面综述了虫草培养基残余体综合利用的研究进展。

1蛹虫草培养基残余体中虫草素、虫草多糖的提取纯化蛹虫草性味甘平，益肺肾，补精髓，止血化痰，用于肺结核、老人虚弱、贫血虚弱等，是一种名贵的中药和高级滋补品，其中虫草素、虫草多糖是蛹虫草的重要活性成分[3]，虫草素在美国作为抗癌新药，已经进入三期临床，具有极高的医药经济价值。

目前，虫草素主要从蛹虫草子实体中提取。

但是，由于蛹虫草子实体的生产成本高，从而导致虫草素的生产成本极高。

研究发现，人工栽培蛹虫草培养基中含有大量的虫草素，与相应的子实体相比，培养基来源充足，价格低廉，作为制备虫草素的原料，可以大大降低成本[4]-[5]。

因此，近年来虫草培养基残余体中虫草素、虫草多糖的提取纯化的研究备受研究者关注。

1.1蛹虫草培养基残余体中虫草多糖、虫草素的提取根据虫草素和虫草多糖溶于水、热乙醇和甲醇的性质，其提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶剂。

提取方法主要有水浴煎煮法、热水回流提取法、索氏提取法、超声波辅助提取法、微波法浸提法、连续逆流提取法等。

虫草多糖的提取：娄虹[6]等采用水浴煎煮法提取蛹虫草大米培养基活性粗多糖，利用正交实验优化提取工艺，从极差分析得出，多糖提取率的影响因素依次为乙醇浓度>提取温度>提取次数，在最佳工艺条件乙醇浓度95%，提取次数4次，提取温度90℃时，多糖的最高得率为0.74%。

任蜀豫[7]等采用正交设计，从人工栽培蛹虫草产生的大量废弃培养料中热水回流提取多糖，并根据极差和方差分析，确定工艺条件对提取量的影响程度由大到小为提取温度、提取时间、料液比、提取次数。

在最佳工艺提取温度80℃，提取2次，提取时间120min，料液比（W/V）1∶20的条件下，测得多糖含量为1.12mg/mL。

梁晨[8]通过对水浴法、超声波法和微波三种提取方法的提取工艺进行研究，得到最佳的蛹虫草培养基多糖提取条件为：2.5g培养基干粉样品，用15倍质量的水，于微波炉中60W下提取1min，之后用20mL乙醇沉淀。

虫草素的提取：钟艳梅[9]等以人工蛹虫草固体培养残基为原料，采用索氏提取法提取：准确称取处理好的样品各10g，共4份，分别加入水、75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇作提取剂，在沸水浴中抽提8h，收集提取液，发现虫草素得率分别为：0.0122%、0.0078%、0.0053%和0.0052%。

谭琪明[10]等用水提取、pH5、料液比1∶50、温度70℃、时间3h的提取工艺从蛹虫草小麦培养基中提取虫草素，提取率可达94.87%。

张丽艳[11]从培养基残基中提取虫草素的技术，优化了虫草素水提醇沉的工艺。

得出最佳水提醇沉工艺条件：40℃提取4次，料液比为1∶20，每次提取2h。

提取液浓缩到废料量的2倍，添加3倍量乙醇，醇沉时间为9h。

王雅玲[12]等以蛹虫草大米培养残基为原料，采用超声波辅助提取法，根据虫草素的理化性质，用不同提取溶剂、温度、时间和pH，进行单因素实验。

结果表明，蛹虫草大米培养残基中虫草素含量为2.011~2.185g/kg。

梁晨[8]采用水浴法、超声波法、微波法和超临界法提取蛹虫草固体培养基中的虫草素，通过正交试验确定了其最佳提取工艺为：称取一定量培养基粉末，用10倍质量的水于微波炉中40W下提取3min，虫草素提取率为42.83%。

韦会平[13]等研究表明蛹虫草培养基残基的主要成分为淀粉类物质。

采用传统的方法提取会加大提取液中杂质的含量，为了高效提取纯化虫草素，以用乙醇和水的混合溶液作溶剂，采用连续逆流提取法从大米培养基中提取虫草素，得到较好的结果，研究从固体培养基中提取纯化虫草素的最佳工艺条件为连续逆流提取：以70%乙醇作溶剂，溶剂/虫草培养基为蛹虫草培养基残余体综合利用的研究进展胡珊罗华建黄皓*陈仕丽梁卫驱李艳芳徐匆（东莞市农业科学研究中心，广东东莞523086）摘要从虫草培养基残余体的虫草素、虫草多糖的提取纯化，在保健食品和饲料中的应用，作为杀虫真菌制剂和用于培养其它微生物等方面综述了虫草培养基残余体综合利用的研究进展。

关键词虫草培养基残余体虫草素提取纯化保健食品饲料文章编号1000-8357（2014）02-0001-03收稿日期：2013-08-14。

作者简介：胡珊，农艺师，硕士，研究方向为农业微生物。

*通信作者。

1dible5mL/g，提取3次。

每次浸泡12h，振荡提取2h。

研究表明超声波法、微波法对虫草多糖、虫草素提取均有较好的效果，由于固体培养基的成分复杂性和特殊性，用连续逆流提取对虫草素表现良好的效果。

此外，李海航[14]运用中药成分提取常用方法柱层析循环提取法，取得良好的提取效果，并达到高效节能。

1.2蛹虫草培养基残余体中虫草多糖、虫草素的纯化虫草多糖的纯化：虫草多糖的分离纯化方法基本分为两步：第一步，除去与多糖紧密结合的糖蛋白；第二步，经柱层析法进一步提纯多糖。

去除糖蛋白的方法有：Sevage法、三氯乙酸法、氯化钙法及盐酸法4种脱蛋白方法。

Sevage法蛋白质清除率较高，且其多糖保留率最高，但在实际生产中，因氯仿毒性较大，对人体伤害较大，不宜采用。

氯化钙法成本低廉、操作简单、脱蛋白效果及多糖保留率尚可，适宜实际生产[15]；进一步纯化多糖采用的柱层析主要有纤维素柱层析和葡聚糖凝胶柱层析，两种方法分离纯化后的多糖纯度均较高。

许晓玮[16]从虫草培养基中纯化虫草多糖是先去除蛋白后，应用DEAE纤维素柱层析和葡聚糖凝胶柱层析均可以分离多糖，但是葡聚糖凝胶价格昂贵，增加了提取成本。

DEAE纤维素柱层析成本低廉，故选用此方法进行虫草多糖分离。

虫草素的纯化：虫草素分离纯化比较常用的方法是活性炭吸附法、硅胶柱层析法、离子树脂吸附法、大孔树脂法等。

活性炭吸附法先经活性炭吸附，再经过洗脱液洗脱和浓缩，得到虫草素晶体，这种方法工艺简单、成本低，但吸附选择性差、得率低[17]。

利用硅胶柱层析法富集虫草素，虫草素相对含量提高，但为了缩短纯化时间，纯硅胶柱色谱分离样品时常需要加压操作，因此不适用于大规模的样品分离[18]。

离子树脂吸附法的关键在于筛选吸附能力较强及吸附量较多的树脂和优化洗脱方法。

目前多用732-NH4+型阳离子交换树脂。

许晓炜[15]用阴离子交换树脂层析法分离、纯化虫草素的工艺路线。

经测定，虫草素精品的纯度均大于97%。

任大明[19]等研究发现在离子交换层析分离虫草素时料水比、洗脱流速为主要影响因子。

固体培养基中虫草素提取分离最优条件为：料水比1∶16，洗脱流速为30滴/min，732阳离子交换树脂柱pH3.5，此时虫草素的得率为最大0.0142%。

梁晨[8]对批量分离蛹虫草培养基提取液中的虫草素做了初步探究，优化，采用732阳离子交换树脂、717阴离子交换树脂和硅胶分离虫草素的操作条件，其中732阳离子交换树脂纯化效果最优。

张丽艳[11]虫草素水提液经过乙醇除杂后，杂质含量仍然很高，需要先对虫草素提取液进行初步分离。

通过对6种阳离子交换树脂静态吸附虫草素的特性进行研究，最终选择JK006树脂用于虫草素的粗纯化。

经过阳离子树脂JK006的初步纯化后，采用717阴离子树脂进一步纯化，得到纯度为96.4%虫草素晶体。

用TLC法、HPLC法、紫外光谱、红外光谱等对获得的虫草素进行定性定量鉴定，确定其与标准品为同一种物质。

采用反吸附不交换的方法，即首先调pH使虫草素不被离子树脂吸附，而无关的离子均被离子树脂吸附，除去干扰成分；然后调pH使虫草素被吸附在柱体上，再经洗脱后获得虫草素结晶，可得纯度高的虫草素晶体。

韦会平[13]等用732阳离子交换树脂柱层析：将提取液浓缩到提取原料的3倍重量，调整其pH为4.0，过滤，得上柱液。

取800mL量的上柱液过732阳离子交换柱（H型），流速2mL/min；然后用1000mL 量的蒸馏水洗柱，流速2mL/min；再用800mL体积的浓度为0.2mol/L的氨水洗脱，流速2mL/min。

将氨洗脱液浓缩20倍，调整其pH9.0，在4℃下结晶得粗品，再分别用甲醇和水进行重结晶得产品。

纯化虫草素产率可达66.0%以上，纯度达98.0%以上。

张松[20]分别选择不同的大孔吸附树脂：S-8、NKA-9、D-101和AB-8进行吸附与解吸，结果发现：D-101对虫草素的吸附与解吸效果较好，反复分离纯化后得到虫草素提取物测定含量达61.55%。

李海航[14]采用DM130大孔树脂对虫草素进行吸附分离，精制步骤采用聚酰胺树脂吸附和沉淀结晶法，真空干燥后可得纯度为98%的虫草素精品。

针对不同虫草培养基原料，其残余体中虫草素和虫草多糖采用不同的提取方法，而每种方法都要经过优化得到其最佳工艺。

工艺不仅要考虑虫草多糖和虫草素的得率、提取速度、原料基质中的残留量及成本等，更重要的是要与后续的纯化方法结合起来，以达到满意的产品纯度和生产的实用性。

2蛹虫草培养基残余体在保健食品和饲料中的应用虫草培养基残余体中含有虫草素、虫草多糖、腺苷等虫草特有的活性物质，此外还含有生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、维生素、SOD等有效成分[21]，许多研究者将其加入食品生产强化食品的功能和风味，亦可作为饲料添加剂。

王春梅等[22]用2%淀粉酶、2%糖化酶水解蛹虫草培养基溶液中碳水化合物，再通过对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的优选实验，优选出最佳水解酶为木瓜蛋白酶，并进行正交实验确定了木瓜蛋白酶的最佳水解条件为：温度55℃，固液比为1∶12，加酶量为2%及水解时间为6h，此时酶解液中游离氨基态氮含量最高，达0.844%，固形物总量为10%，并含有一定的虫草多糖和虫草素，经浓缩、干燥后可作为各种保健食品和调味品的基料或添加剂。

车振明[23]研究在酱油酿造过程中添加5%~10%的人工蛹虫草培养基残基后对所酿造的酱油在感官指标和理化指标上明显优于普通酱油，且营养丰富，具有浓郁的虫草香味。