[讲义]高效液相色谱!
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱的基本参数讲义
空柱管体积（Vc ) * 总孔隙度（εT)
to=
流动相体积流速（F c)
= π/4 *d²c *L * εT/Fc
计算孔隙度
4
§2 选择性指标( )和相对保留值()
´= t r(2) / tr(1) =(1+ k´(2)/(1+ k´(1)) = t r '(2) / tr' (1) = k´(2) / k´(1) ´作为选择性指标比 直观
溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)
nm Vs
ns, nm 溶质在固定相和流动相中的量
2
(3) 调整保留时间
tr´= tr - to
V = VR - Vm
(4) 容量因子 (k’)
固定相中容质的量(ns)
k´=------------------------
流动相中容质的量(nm)
K = k´(Vm/ Vs)
色谱柱接连流出分离良好的色谱峰，所能够分离 的最大组分数。
为了使总分离效能指标能直接与所分析组分的 多少相关联，可以采用峰容量（P）来评价色谱柱。 色谱条件一定时，在指定的时间内，能够在色谱柱 中流出的满足分离度要求的等高色谱峰的个数。
20
21
快速色谱
tr(last) = H /u * Nmin (1+k‘last )
▪ 颗粒度越小柱效越高
• 颗粒度控制着分离的 质量
▪ 更小的颗粒度：
• 使最高柱效点向更高 线速度方向移动
• 有更宽的线速度范围
▪ 降低颗粒度不但可以 增加柱效，同时也增 加分离速度
如果填料的颗粒继续演变……
更小的颗粒度……
被n)
Linear velocity(u,mm/sec)
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱技术(HPLC)讲义
1407 高效液相色谱技术（HPLC ）高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
7.1 基本原理固定相 流动相AB CCBA固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：—— 分配系数亲和色谱：—— 亲和力吸附色谱：—— 吸附力离子交换色谱：—— 离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
中国药典 高效液相色谱讲义
26
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
英国药典2000年版
? 附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
? 除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱
? 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
? 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
? 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
? 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；
? 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的 化合物均有响应；
? 蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品 的质量有关；
? 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
16
分离度(R)
? 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
[讲义]高效液相色谱!
![[讲义]高效液相色谱!](https://img.taocdn.com/s3/m/e3da237631b765ce050814de.png)
6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求。 7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成 为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领 域。
8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出 的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品 化的离子色谱仪问世。 9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非 抑制型离子色谱仪。
结论：
四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数
除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
按固定相的固定方式分：
第一节 高效液相色谱的特点
高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年
代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型 的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。
20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛
起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间 很长，因而未受到重视。
径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质 凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
（一）吸附色谱法
要求： 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分离机制：见图示
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附 剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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要求： 固定相→多孔性凝胶 流动相→水——凝胶过滤色谱 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱 分离机制见图示
[X S ] [X m ]
渗透系数
KP
注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小， 与流动相的性质无关 next
图示
分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离
二、色谱法定义、分离基础和目的
定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例
分离基础：差速迁移 (例:赛跑)
目的：多组分分离，实现定性定量分析
图示
石油醚 流动相
碳酸钙
色素
吸附剂
分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
方法缩写 方法全称 分子量范围 能检测的有机化 合物的比重
GPC HPLC GC
凝胶渗透色谱 高效液相色谱法 气相色谱法
＞103 400--2000 10—400 80—85% 15—20%
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测。
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示
2、20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对 植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。
3、30～40年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文。 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、 吸附色谱和电泳领域取得了成果。 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱。
反相分配色谱：极性强的组分先出柱。
（三）离子交换色谱法
要求：
固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液
被分离组分→离子型的有机物或无机物 分离机制见图示
阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
[ RSO3 X ]S [H ]m [ RSO3 H ]S [ X ]m
经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在 大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶 质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有 低柱效，分析时间很长。 高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口 径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的 色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而
径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质 凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
（一）吸附色谱法
要求： 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分离机制：见图示
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附 剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开
注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关 next
图示
分离机制
利用组分在ห้องสมุดไป่ตู้动相和固定相间溶解度差别实现分离，是 一个连续萃取过程。
分配色谱法分类
正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性 反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性
正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）
四、高效液相色谱法的特点
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相， (键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；
高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检
测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。
与气相色谱法相比
高效液相色谱法
经典液相色谱法
2. HPLC与GC的比较
高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有 选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于 分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子 和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。 在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相 色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进 行分离和分析，此两种方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围
第一节 高效液相色谱的特点
高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年
代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型 的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。
20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛
起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间 很长，因而未受到重视。
结论：
四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、 分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数
除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响
按固定相的固定方式分：
三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较
从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）
色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、
高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱 法焕发出新的活力。
三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较
缺点： 对未知物分析的定性专属性差
需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
思考题：高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和 不同之处？
第二节 HPLC分类
按分离机制分类：
分配色谱法
吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
基本类型色谱法的分离机制
对于不同的分离机理，K的含义不同。
吸附色谱 吸附系数
分配色谱
离子交换色谱 分子排阻色谱
分配系数
离子交换系数 分子排阻系数 统称K
1.
吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固
定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的 硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多 元溶剂。 2. 分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上
（二）分配色谱法
要求： 固定相→机械吸附在惰性载体上的液体 流动相→不能与固定相互溶 载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反 应
分离机制见图示 分配系数
Cs X s Vs K Cm X m Vm
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积
Cs为溶质分子在固定相中 的浓度 Cm为溶质分子在流动相中 的浓度
6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求。 7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成 为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领 域。
8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出 的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品 化的离子色谱仪问世。 9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非 抑制型离子色谱仪。
涂渍一薄层固定液制备固定相, 担体表面。
现多为化学键合固定
相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在
3. 离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为 无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树 脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 4. 空间排阻色谱（凝胶色谱）：以凝胶为固定相。凝
胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔
10、20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术—毛细管电 泳技术随之出现。 11、20世纪90年代以后，ELSD一种新型的检测器出现， 改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。 12、20世纪90年代中期以后，用于HPLC的MS检测器开 始普及，使液相进入定性的时代。
进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破： Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。 2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。 借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、 高通量的分析。 2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相 色谱的最新技术突破，Corona™带电气溶胶检测器 （CAD）诞生，新一代的通用型检测器。 2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。 HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。
不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广； 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大 作用，选择性高； 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
优点：“三高”、“一快”、“一广” 高选择性——可将性质相似的组分分开 高效能——反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广——气体，液体、固体物质