微生物 基因工程菌
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酵母菌作为基因工程菌的优势
1. 酵母菌是最成熟的真核生物表达系统 2. 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单 3. 具有原核生物无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 4. 大规模发酵历史悠久，技术成熟，工艺简单，成本低廉。 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中 6. 不含有特异性的病毒，不产内毒素
传统酵母转化系统
先使纤维素酶基因与表达载体相结合，再将重组体转入酵母细 胞内形成转化子，表达目的基因，从而产生纤维素酶蛋白，这 是传统酵母转化系统。目前有 2种方法可以使酵母细胞摄取外 源 DNA ，即原生质体转化和完整细胞转化。现在采用较多的 是完整细胞转化的方法，该方法是1983年发展起来的。此方法 虽然要用Li离子处理细胞，但和原生质体转化方法相比，则比 较简单，在筛选转化子时，不必进行细胞壁再生，而且Li离子 处理完整酵母细胞的转化率比原生质体的高。但必须用聚乙二 醇处理转化细胞，否则转化率会大幅度下降。
9
2019/12/18
酵母表面展示系统
2019/12/18
11
酵母表面展示系统的类型
目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素 展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编 码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合 蛋白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌， 由于融合蛋白C 末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞 壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统 利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面， 此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚 定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能 结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露 聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。
优势 基因克隆表达系统完善
全基因组测序，共有4405个开放型 阅读框架
繁殖迅速、培养简单、操作方便、 遗传稳定
被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物
4
工程菌高密度发酵工艺
自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验 室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的 是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载 体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远 不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度 培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的 缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程 中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大， 溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在 进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密 度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度 更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果 导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源 基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还 需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。 需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的 消泡剂。
酵母菌
6
酵母菌在工程菌中的应用
单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰 能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早， 也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因---干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达干扰素和胰岛素虽然已经利 用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓 舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷 贝数的选择压力消失质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素， 因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复 杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵 母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以 Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速， 应用也最为广泛。
基因工程菌
大肠杆菌
2
被选为基因工程菌的原因
常见易得，易于培养 质粒为常用运载体 代谢迅速, 经济高效
基因工程菌的通性
3
作为表达外源百度文库因受体菌的优劣比较
劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工 系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确 的异源蛋白
细胞周质内含有种类繁多的内霉素
酵母菌作为基因工程菌的优势
1. 酵母菌是最成熟的真核生物表达系统 2. 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单 3. 具有原核生物无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 4. 大规模发酵历史悠久，技术成熟，工艺简单，成本低廉。 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中 6. 不含有特异性的病毒，不产内毒素
传统酵母转化系统
先使纤维素酶基因与表达载体相结合，再将重组体转入酵母细 胞内形成转化子，表达目的基因，从而产生纤维素酶蛋白，这 是传统酵母转化系统。目前有 2种方法可以使酵母细胞摄取外 源 DNA ，即原生质体转化和完整细胞转化。现在采用较多的 是完整细胞转化的方法，该方法是1983年发展起来的。此方法 虽然要用Li离子处理细胞，但和原生质体转化方法相比，则比 较简单，在筛选转化子时，不必进行细胞壁再生，而且Li离子 处理完整酵母细胞的转化率比原生质体的高。但必须用聚乙二 醇处理转化细胞，否则转化率会大幅度下降。
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2019/12/18
酵母表面展示系统
2019/12/18
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酵母表面展示系统的类型
目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素 展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编 码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合 蛋白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌， 由于融合蛋白C 末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞 壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统 利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面， 此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚 定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能 结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露 聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。
优势 基因克隆表达系统完善
全基因组测序，共有4405个开放型 阅读框架
繁殖迅速、培养简单、操作方便、 遗传稳定
被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物
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工程菌高密度发酵工艺
自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验 室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的 是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载 体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远 不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度 培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的 缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程 中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大， 溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在 进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密 度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度 更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果 导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源 基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还 需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。 需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的 消泡剂。
酵母菌
6
酵母菌在工程菌中的应用
单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰 能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早， 也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因---干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达干扰素和胰岛素虽然已经利 用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓 舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷 贝数的选择压力消失质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素， 因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复 杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵 母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以 Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速， 应用也最为广泛。
基因工程菌
大肠杆菌
2
被选为基因工程菌的原因
常见易得，易于培养 质粒为常用运载体 代谢迅速, 经济高效
基因工程菌的通性
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作为表达外源百度文库因受体菌的优劣比较
劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工 系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确 的异源蛋白
细胞周质内含有种类繁多的内霉素