碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制及其所致医院感染控制研究

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制及其所致医院感染控

制研究

肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌等,是引起医院感染最常见的病原菌。据历年上海地区和CHINET全国细菌耐药性监测结果显示,肠杆菌科细菌占所有革兰阴性菌的60-70%。

碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等是临床治疗肠杆菌科细菌尤其是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐药菌株引起感染的最有效的抗菌药物。然而,随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用,耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, CRE)正在医院内悄悄出现。

如在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的耐药率也已经由早年的零上升到1%；在肠杆菌科的其他一些菌属已经有7.0%的耐药率。在非发酵菌的某些菌属的耐药率也已经上升为20%-30%。

由于大多数对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌同时也对许多临床常用的抗生素耐药,成为泛耐药菌株,对病人的生命构成极大的威胁。该类药物在临床的应用受到严峻的挑战。

对2005年-2009年华山医院所有分离的CRE菌株临床资料的分析结果发现,同一病床的不同时间入院患者均能分离到CRE菌株,如神经外科病房的某一床位,2005年8月、2006年1月、2007年3月和2007年9月分别从四位不同的患者分离到碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括3株弗劳地柠檬酸杆菌和1株肺炎克雷伯菌;同一患者亦能分离到不同菌属的CRE菌株,如鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌组、弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌组、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌组

等。因此,我们推测CRE菌株在医院范围内广泛播散的机制主要有以下两种：①水平传播：携带碳青霉烯酶如KPC-2型酶的质粒在不同细菌间进行直接转移；使敏感株成为耐药株；②克隆传播：CRE菌株通过各种方式在不同患者间克隆传播而导致医院感染暴发流行的发生。

尽管CRE菌株已逐年增加且呈暴发流行的趋势,但目前国内的的研究大多集中于耐药机制的研究,对该类菌株如何在不同种属细菌间广泛播散的传播机制尚缺乏深入的研究,对该类菌株引起的医院感染的危害性亦未得到足够的重视。Kochar等人通过加强手卫生和环境表面消毒成功减少碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的传播。

但有关此方面的研究国内尚未见报道。由于CRE菌株引起的感染大多为重症感染且目前临床并无有效的治疗药物可供选择,尤其是对于CRE菌株引起的中枢神经系统感染更是如此。

与往年相比,2009年碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌的发生率在快速的上升,如再不采取有效的医院感染控制措施加以控制,该类菌株引起的大爆发流行所给患者带来的灾难性后果将不可避免。因此,了解CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,采取有效的措施控制该类菌株引起的医院感染的发生及暴发流行已是迫在眉睫。

本课题旨在通过分子生物学技术与临床流行病学调查相结合的方式揭示CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,为采取行之有效的医院感染控制措施以及时遏制该类菌株引起的持续感染和暴发流行提供实验室和临床依据,这对促进临床抗感染治疗的合理用药以及患者的康复将产生积极的影响,同时也将带来极大的社会效益和经济效益。本研究内容共包括以下四部分。

细菌产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制之一,文献报道,该类菌株还可产生超广谱β内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases, ESBLs)和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白缺失等。为检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,美国临床实验室标准化研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)于2009年推荐了改良Hodge试验,用于肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测。

该法最初是由Wavell hodge建立的一种用于检测产青霉素酶淋病奈瑟菌的试验。之后多位学者用此方法或进行改良用于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中金属酶的检测以及大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的CMY-1型AmpC酶的检测。

华山医院于2005年首次出现CRE菌株,随后我们通过细菌耐药监测系统连续对此类菌株的出现进行了监测。2005年1月-2009年12月间我们共分离到220株对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,包括克雷伯菌属161株(其中肺炎克雷伯菌158株,产酸克雷伯菌3株)、柠檬酸杆菌属41株(其中弗劳地柠檬酸杆菌35株,其他柠檬酸杆菌6株)、大肠埃希菌6株、阴沟肠杆菌4株、奇异变形杆菌3株、粘质沙雷菌2株、产气肠杆菌1株、支气管博得特菌1株和斯氏普罗威登菌1株。

纸片扩散法药敏试验结果显示,2005年-2008年华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等抗菌药的耐药率在2%以下,但2009年快速上升至16%左右；弗劳地柠檬酸杆菌2005年对碳青霉烯类抗生素的耐药率在10%,2006年快速上升至45%左右,2007年-2009年维持在35%左右。琼脂稀释法检测2005年-2009年中的78株CRE菌株的药敏试验结果显示,对亚胺培南、美罗培南、厄他培南和粘菌素的敏感率分别为16.4%、17.9%、1.3%和96.0%。

上述药物对78株CRE菌株的MIC50/MIC90分别为32/256 mg/L、

64/>256mg/L、128/>256mg/L和1/1mg/L。改良Hodge试验对78株CRE 菌株中的碳青霉烯酶进行了检测。

结果显示：93.6%(73/78)的菌株为阳性,提示这些菌株可能产碳青霉烯酶。采用PCR法对78株CRE菌株进行了各种碳青霉烯酶基因、ESBLs和质粒AmpC酶基因的检测及DNA测序结果显示,33.3%(26/78)的菌株产KPC-2型碳青霉烯酶,且其中分别有7.7%(2/26)、7.7%(2/26)、3.8%(1/26)的菌株同时伴有VIM-1、IMP-2和IMP-1型金属酶。

6.4%(5/78)、5.1%(4/78)、3.8%(3/78)、6.4%(5/78)和12.8%(10/78)的菌株分别产VIM-1、IMP-1、IMP-2、GIM和OXA-69型碳青霉烯酶基因。多重PCR 检测结果显示,20.5%(16/78)的菌株产OXA-23like、OXA-51like或OXA-58like 型碳青霉烯酶。

VIM-2、SPM、NMC、IMI、IND、OXA-48、OXA-50、OXA-55、OXA-60和OXA-24like 碳青霉烯酶基因检测结果全为阴性。PFGE同源性分析：按Tenover标准,25株弗劳地柠檬酸杆菌分为3种不同的DNA谱型(A-C),其中15株产KPC-2型酶的菌株为同一谱型(A),提示存在克隆菌株传播流行可能。

43株肺炎克雷伯菌分为10个不同的DNA谱型(A-J),9株产KPC-2型酶菌株中7株为同一谱型(J),其余2株为同一谱型(I)；不产KPC-2型酶的CRE菌株间亦存在克隆菌株的传播流行。外膜孔蛋白分析：SDS-PAGE电泳结果显示,与敏感菌株相比,29.5%(23/78)的CRE菌株至少缺失OmpK35和OmpK36中的1条或两者全部缺失,60.3%(47/78)的菌株外膜孔蛋白均存在表达下降现象,提示外膜蛋白在CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药过程中发挥了重要作用。

接合试验：对产KPC-2型碳青霉烯酶基因的6株肺炎克雷伯菌(其中2株同