碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制及其所致医院感染控制研究

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制及其所致医院感染控
制研究
肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌等,是引起医院感染最常见的病原菌。

据历年上海地区和CHINET全国细菌耐药性监测结果显示,肠杆菌科细菌占所有革兰阴性菌的60-70%。

碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等是临床治疗肠杆菌科细菌尤其是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐药菌株引起感染的最有效的抗菌药物。

然而,随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用,耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, CRE)正在医院内悄悄出现。

如在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的耐药率也已经由早年的零上升到1%；在肠杆菌科的其他一些菌属已经有7.0%的耐药率。

在非发酵菌的某些菌属的耐药率也已经上升为20%-30%。

由于大多数对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌同时也对许多临床常用的抗生素耐药,成为泛耐药菌株,对病人的生命构成极大的威胁。

该类药物在临床的应用受到严峻的挑战。

对2005年-2009年华山医院所有分离的CRE菌株临床资料的分析结果发现,同一病床的不同时间入院患者均能分离到CRE菌株,如神经外科病房的某一床位,2005年8月、2006年1月、2007年3月和2007年9月分别从四位不同的患者分离到碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括3株弗劳地柠檬酸杆菌和1株肺炎克雷伯菌;同一患者亦能分离到不同菌属的CRE菌株,如鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌组、弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌组、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌组
等。

因此,我们推测CRE菌株在医院范围内广泛播散的机制主要有以下两种：①水平传播：携带碳青霉烯酶如KPC-2型酶的质粒在不同细菌间进行直接转移；使敏感株成为耐药株；②克隆传播：CRE菌株通过各种方式在不同患者间克隆传播而导致医院感染暴发流行的发生。

尽管CRE菌株已逐年增加且呈暴发流行的趋势,但目前国内的的研究大多集中于耐药机制的研究,对该类菌株如何在不同种属细菌间广泛播散的传播机制尚缺乏深入的研究,对该类菌株引起的医院感染的危害性亦未得到足够的重视。

Kochar等人通过加强手卫生和环境表面消毒成功减少碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的传播。

但有关此方面的研究国内尚未见报道。

由于CRE菌株引起的感染大多为重症感染且目前临床并无有效的治疗药物可供选择,尤其是对于CRE菌株引起的中枢神经系统感染更是如此。

与往年相比,2009年碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌的发生率在快速的上升,如再不采取有效的医院感染控制措施加以控制,该类菌株引起的大爆发流行所给患者带来的灾难性后果将不可避免。

因此,了解CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,采取有效的措施控制该类菌株引起的医院感染的发生及暴发流行已是迫在眉睫。

本课题旨在通过分子生物学技术与临床流行病学调查相结合的方式揭示CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的机制,为采取行之有效的医院感染控制措施以及时遏制该类菌株引起的持续感染和暴发流行提供实验室和临床依据,这对促进临床抗感染治疗的合理用药以及患者的康复将产生积极的影响,同时也将带来极大的社会效益和经济效益。

本研究内容共包括以下四部分。

细菌产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制之一,文献报道,该类菌株还可产生超广谱β内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases, ESBLs)和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白缺失等。

为检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,美国临床实验室标准化研究所(Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI)于2009年推荐了改良Hodge试验,用于肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测。

该法最初是由Wavell hodge建立的一种用于检测产青霉素酶淋病奈瑟菌的试验。

之后多位学者用此方法或进行改良用于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中金属酶的检测以及大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的CMY-1型AmpC酶的检测。

华山医院于2005年首次出现CRE菌株,随后我们通过细菌耐药监测系统连续对此类菌株的出现进行了监测。

2005年1月-2009年12月间我们共分离到220株对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,包括克雷伯菌属161株(其中肺炎克雷伯菌158株,产酸克雷伯菌3株)、柠檬酸杆菌属41株(其中弗劳地柠檬酸杆菌35株,其他柠檬酸杆菌6株)、大肠埃希菌6株、阴沟肠杆菌4株、奇异变形杆菌3株、粘质沙雷菌2株、产气肠杆菌1株、支气管博得特菌1株和斯氏普罗威登菌1株。

纸片扩散法药敏试验结果显示,2005年-2008年华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等抗菌药的耐药率在2%以下,但2009年快速上升至16%左右；弗劳地柠檬酸杆菌2005年对碳青霉烯类抗生素的耐药率在10%,2006年快速上升至45%左右,2007年-2009年维持在35%左右。

琼脂稀释法检测2005年-2009年中的78株CRE菌株的药敏试验结果显示,对亚胺培南、美罗培南、厄他培南和粘菌素的敏感率分别为16.4%、17.9%、1.3%和96.0%。

上述药物对78株CRE菌株的MIC50/MIC90分别为32/256 mg/L、
64/>256mg/L、128/>256mg/L和1/1mg/L。

改良Hodge试验对78株CRE 菌株中的碳青霉烯酶进行了检测。

结果显示：93.6%(73/78)的菌株为阳性,提示这些菌株可能产碳青霉烯酶。

采用PCR法对78株CRE菌株进行了各种碳青霉烯酶基因、ESBLs和质粒AmpC酶基因的检测及DNA测序结果显示,33.3%(26/78)的菌株产KPC-2型碳青霉烯酶,且其中分别有7.7%(2/26)、7.7%(2/26)、3.8%(1/26)的菌株同时伴有VIM-1、IMP-2和IMP-1型金属酶。

6.4%(5/78)、5.1%(4/78)、3.8%(3/78)、6.4%(5/78)和12.8%(10/78)的菌株分别产VIM-1、IMP-1、IMP-2、GIM和OXA-69型碳青霉烯酶基因。

多重PCR 检测结果显示,20.5%(16/78)的菌株产OXA-23like、OXA-51like或OXA-58like 型碳青霉烯酶。

VIM-2、SPM、NMC、IMI、IND、OXA-48、OXA-50、OXA-55、OXA-60和OXA-24like 碳青霉烯酶基因检测结果全为阴性。

PFGE同源性分析：按Tenover标准,25株弗劳地柠檬酸杆菌分为3种不同的DNA谱型(A-C),其中15株产KPC-2型酶的菌株为同一谱型(A),提示存在克隆菌株传播流行可能。

43株肺炎克雷伯菌分为10个不同的DNA谱型(A-J),9株产KPC-2型酶菌株中7株为同一谱型(J),其余2株为同一谱型(I)；不产KPC-2型酶的CRE菌株间亦存在克隆菌株的传播流行。

外膜孔蛋白分析：SDS-PAGE电泳结果显示,与敏感菌株相比,29.5%(23/78)的CRE菌株至少缺失OmpK35和OmpK36中的1条或两者全部缺失,60.3%(47/78)的菌株外膜孔蛋白均存在表达下降现象,提示外膜蛋白在CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药过程中发挥了重要作用。

接合试验：对产KPC-2型碳青霉烯酶基因的6株肺炎克雷伯菌(其中2株同
时产VIM-1型金属酶)和3株弗劳地柠檬酸杆菌的接合试验结果显示,所有9株细菌均在选择性平板上获得转移接合子。

药敏试验及β内酰胺酶基因PCR检测结果显示,供体菌中所含的ESBL基因均成功转移至受体菌中,转移接合子均表现为对第三代头孢菌素耐药。

但KPC-2型碳青霉烯酶或VIM-1型金属酶基因均未能从供体菌转移至受体菌。

转化试验亦未能将此两种碳青霉烯酶基因转移至受体菌,推测该耐药基因可能位于染色体上,或可能含有KPC-2型碳青霉烯酶基因的质粒过大而导致接合或转化试验失败。

同一病床的不同时间入院患者均能分离到CRE菌株,同一患者亦能分离到不同种属的CRE菌株,以及在某些患者身上,经常看到这样一种现象：最初分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素是敏感的,但经过一段时间的治疗后变得对碳青霉烯类抗生素耐药。

为在体外模拟体内菌株出现的上述现象,我们采用接合试验尝试对这一演变过程进行复制,以期能够初步解释CRE菌株在不同种属细菌间广泛播散的现象。

本研究对同一患者临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌A1979和碳青霉烯类敏
感的肺炎克雷伯菌K1980进行了接合试验,利用厄他培南和舒巴坦作为接合子菌株筛选药物,成功筛选到了鲍曼不动杆菌A1979和肺炎克雷伯菌K1980菌株的接合子,药敏试验结果证实接合子菌株对厄他培南、亚胺培南和美罗培南均表现为耐药。

ERIC-PCR和PFGE试验均证实对碳青霉烯类药物抗生素耐药的接合子菌株与敏感的受体菌的ERIC-PCR和PFGE谱型完全一致。

由于此次选择的供体菌鲍曼不动杆菌A1979其产金属酶的种类尚未知晓,因此接合子菌株中含有哪一种金属酶基因仍有待进一步的研究。

在后续的进一步研
究中,我们将选择更多的菌株进行类似的直接的接合试验。

并对接合试验所获得的接合子菌株以及供体菌和受体菌中的耐药质粒DNA 分别进行测序分析,以从分子生物学水平解释碳青霉烯酶在不同种属细菌间转移的机制。

我们对神经外科病房某一床位进行了调查。

该床位频繁地住过CRE菌株感染患者或定植者。

采用含1片厄他培南(10μg)纸片的5毫升MH肉汤的增菌法从患者肛周标本、尿道口标本以及氧气湿化瓶中的水样标本中均分离到了对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌。

PFGE同源性分析证实分离自这3份标本中的3株菌株为同一PFGE谱型。

同时采集该病房7位患者床头的氧气湿化瓶中的水样标本,结果发现从其中5名患者的湿化瓶水样中分离出了对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括2株肺炎克雷伯菌、3株鲍曼不动杆菌和1株嗜麦芽窄食单胞菌等。

而对神经外科某一病房的环境标本及工作人员的一次集中采样筛选CRE菌株结果显示,病床左右栏杆及桌子台面的环境标本,护士的手上以及输液泵屏幕上均存在碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌。

提示氧气湿化瓶和医院环境中存在的CRE菌株可能是在医院环境中引起各种感染尤其是呼吸道感染的关键传播源头之一。

对78株CRE菌株感染患者的病史资料回顾性调查分析结果显示,发现多种抗菌药物的应用以及引流管包括导尿管和脑脊液引流管的留置可能是导致CRE菌株感染和难以清除的危险因素；CRE菌株携带或感染患者在不同床位和病房之间的频繁轮流更换可能是导致CRE菌株在医院范围内广泛播散的关键因素。

通过上述研究,得出以下结论：1.药敏试验结果显示,自华山医院分离的肠杆菌科细菌,包括肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌等菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南
的耐药率高。

其中CRE菌株绝大多数为对碳青霉烯类抗生素高度耐药株。

亚胺培南、美罗培南和厄他培南对其的的MIC90均≥256 mg/L。

这些CRE菌株绝大多数分离于神经外科病房患者,并以尿液标本与呼吸道标本的分离株为主。

2.改良Hodge试验对78株CRE菌株中的碳青霉烯酶检测的结果显示,93.6%(73/78)的菌株为碳青霉烯酶产生株。

与PCR法检测碳青霉烯酶基因结果相比,其检测灵敏度和特异性分别为97.9%、12.9%。

3.PCR检测耐药基因结果及SDS-PAGE电泳分析外膜孔蛋白结果显示,60.3%(47/78)的菌株产碳青霉烯酶,其中33.3%(26/78)产KPC-2型酶。

产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一。

35.9%(28/78)的菌株至少丢失1条外膜孔蛋白,提示产生ESBLs和/或质粒AmpC 酶且同时合并外膜孔蛋白丢失是导致CRE菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的另一个重要的耐药机制。

4.虽经多次接合试验和转化试验,但编码KPC-2型碳青霉烯酶的基因始终无法从供体菌转移至敏感菌中,但供体菌中的ESBLs基因却在接合的过程中进行了转移。

推测编码KPC-2型碳青霉烯酶的基因可能位于染色体上,或与ESBLs基因分别存在于不同的耐药质粒上。

5. PFGE同源性分析结果显示,碳青霉烯类抗生素耐药的弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌均存在克隆菌株在不同病房之间的流行和传播。

6.含1片厄他培南(10μg)纸片的5毫升MH肉汤增菌法可提高从各类标本中筛选碳青霉烯类抗生素耐药菌株的检测率,可作为医院感染调查的推荐检测方法。

7.流行病学调查研究结果显示,神经外科病房多数氧气湿化瓶中均检测到碳
青霉烯类抗生素耐药的菌株,包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌等。

病床周围、医护人员手部以及患者肛周均携带有CRE菌株。

上述因素可能是导致CRE菌株在医院环境广泛播散引起各种感染尤其是呼吸道感染的关键传播源头。

8.本研究调查初步结果显示,手卫生和加强医院环境消毒卫生将是阻断碳青霉烯类药物耐药菌株在医院环境内广泛播散的关键措施。

及时采取有效地医院感染控制措施限制耐药菌株尤其是碳青霉烯类药物耐药菌株的播散将成为当务之急。