质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。
在这一过程中，我们需要合成包含目标基因序列的质粒，并将其转化到酵母菌细胞中。
下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。
1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。
在酵母菌表面展示中，我们需要构建一种质粒，其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。
a. 选择适合的质粒载体：选择合适的质粒载体，例如pYD1或pPICZα，这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。
b. 插入目标基因：根据目标基因的序列设计引物，通过PCR扩增目标基因，并在引物的末端添加限制酶切序列，以便后续的质粒构建。
c. 酶切和连接：将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切，并使用连接酶将两者连接起来。
此步骤需要选择合适的限制酶，并优化酶切和连接的条件。
d. 转化大肠杆菌：将连接好的质粒转化到大肠杆菌中，并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。
2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后，我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。
转化是指将质粒导入到细胞内，并使其在细胞内复制和表达。
a. 制备质粒：从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。
使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。
b. 酵母菌预处理：用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。
这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。
c. 质粒转化：将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。
孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。
质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等，选择合适的方法进行转化。
d. 筛选阳性克隆：将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中，并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。
这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。
在每个步骤中，实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具，并根据实验要求进行优化。
通过这一步骤，可以成功构建和导入目标质粒，为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一般普通质粒扩增：先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。
根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。
LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：①取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
②取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30分钟。
③42℃热休克120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。
冰浴5 分钟，然后转移到事先预热至37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时30 分钟。
④用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的LA平板。
⑤铺菌的LA 平板于37℃正放2~3 小时，然后倒置培养16-24 小时。
⑥将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：①将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
②再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
③将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。
然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。
④将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10小时。
质粒生产工艺
质粒生产工艺质粒生产工艺是生物技术领域中重要的研究方向之一。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细胞内自我复制和传递基因信息。
质粒生产工艺是指通过基因工程技术，将目标基因插入质粒中，并将质粒引入宿主细胞中，实现目标基因的表达和生产。
质粒生产工艺的关键步骤包括质粒构建、质粒提取和质粒转染等。
首先，需要选择合适的质粒载体，一般选择具有高复制能力和稳定性的质粒。
质粒载体通常包含了起始子、启动子、终止子和选择标记等功能元件，以确保目标基因能够在宿主细胞中得到正常表达。
质粒构建是质粒生产工艺的核心步骤之一。
在质粒构建过程中，需要将目标基因插入质粒的多克隆位点中。
常用的质粒构建方法有限制性内切酶切剪、连接酶法和PCR扩增等。
在限制性内切酶切剪法中，首先将目标基因和质粒载体通过限制性内切酶的作用，切割成互补的末端。
然后，通过连接酶的作用，将目标基因与质粒载体连接起来。
最后，将构建好的质粒转化到宿主细胞中。
质粒提取是质粒生产工艺的另一个重要步骤。
质粒提取的目的是从宿主细胞中分离出质粒。
常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法和商业化提取试剂盒等。
在碱裂解法中，首先通过细菌培养扩增质粒的数量。
然后，使用碱溶液破坏细菌细胞壁，释放质粒。
接下来，通过酸性中和和酒精沉淀的步骤，将质粒从混合物中分离出来。
质粒转染是质粒生产工艺的最后一步。
质粒转染是将构建好的质粒引入宿主细胞中的过程。
质粒转染的方法有多种，包括热激法、电穿孔法和化学法等。
在热激法中，首先将质粒与细胞一起暴露在高温下，使细胞膜通透性增加。
然后，在室温下快速冷却，使质粒能够进入细胞内。
在电穿孔法中，通过电场作用，使细胞膜产生孔隙，质粒通过孔隙进入细胞内。
在化学法中，通过化学试剂改变细胞膜的性质，使质粒能够进入细胞内。
总结起来，质粒生产工艺是通过将目标基因插入质粒中，并将质粒引入宿主细胞中，实现目标基因的表达和生产的过程。
质粒生产工艺包括质粒构建、质粒提取和质粒转染等关键步骤。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
质粒转染步骤
质粒转染步骤引言：质粒转染是基因工程中常用的实验技术之一，用于将外源基因导入目标细胞内，从而使目标细胞表达外源蛋白或产生特定的功能。
本文将详细介绍质粒转染的步骤及相关注意事项。
一、质粒制备在进行质粒转染实验前，首先需要制备质粒。
质粒通常由DNA构成，可由质粒抽提试剂盒等方法进行提取。
提取质粒的关键是确保DNA质量和纯度，以及质粒的浓度，这将直接影响到后续转染的效果。
二、细胞培养在进行质粒转染前，需要培养目标细胞。
细胞培养的关键是选择适当的培养基和培养条件，以保证细胞的健康生长。
细胞的形态、生长速度和细胞密度等因素需要在细胞培养过程中进行监测和调整。
三、质粒转染试剂的选择质粒转染试剂是实现质粒导入细胞的关键。
根据不同的细胞类型和转染目的，可以选择不同的转染试剂，如磷脂体转染试剂、聚合物转染试剂等。
在选择转染试剂时，需考虑其转染效率、细胞毒性和适用细胞类型等因素。
四、质粒转染步骤1. 细胞处理：将培养好的细胞用适当的培养基洗涤，并吸取适量的细胞悬液。
2. 质粒与转染试剂的混合：将提取好的质粒与转染试剂按照一定比例混合，形成转染复合物。
注意避免过高的转染试剂浓度，以免对细胞产生毒性影响。
3. 转染复合物的加入：将转染复合物缓慢加入细胞悬液中，充分混合，并保持一定的转染时间。
转染时间的长短需根据实验要求来确定。
4. 转染条件的优化：根据实验需要，可以对转染条件进行优化，如转染时间、转染温度、转染复合物的浓度等。
5. 转染后的培养：转染完成后，将细胞悬液转入含有适当选择性抗生素的培养基中进行培养，以筛选成功转染的细胞。
五、转染效果的验证转染完成后，需要进行转染效果的验证。
常用的验证方法包括荧光显微镜观察、蛋白质表达分析、PCR验证等。
根据实验要求，选择合适的验证方法，评估转染效果。
六、注意事项1. 转染试剂的质量需经过严格检测和筛选，确保其稳定性和转染效率。
2. 转染过程中需注意无菌操作，避免细菌、真菌等污染对实验结果的影响。
重组载体质粒扩增流程
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载重组载体质粒扩增流程地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容重组载体质粒扩增的实验步骤：Ⅰ、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法）准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L 氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（ stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏)。
2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养（纯化）。
3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。
4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300ml LB培养基中，在37℃ 220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。
以下步骤开始注意无菌操作：6．将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟；7．4℃下3000g冷冻离心10分钟；8．弃去上清，加入 30ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；9．4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加入 5ml预冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；4℃下3000g冷冻离心10分钟；弃去上清，加6ml 0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后，分装成100μl或200ul/EP管（4℃预冷），-80℃冷冻贮存备用。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。
本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。
质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。
在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。
2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。
在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。
3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。
PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。
在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。
常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。
连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。
2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。
3.连接酶在37℃下反应数小时。
4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。
转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。
转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。
常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
质粒大抽步骤
质粒大抽（手提）步骤资料来自网络，适当改进试剂配制：Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。
Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
1M NaOH (400ml )：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml 双蒸水中。
2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml 双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。
10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。
Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml 双蒸水，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。
Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml 双蒸水，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。
(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。
质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤
质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。
转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ，M- ）。
将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。
进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。
将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。
本实验采用 CaCl2 法制备感受态细胞。
其原理是细胞处于 0 ～4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。
转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。
含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。
【试剂与器材】1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。
2 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3 ． 0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。
4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 ℃保存。
质粒转染实验步骤
质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中至关重要的一步，转染的效率直接影响着整体实验的成败，本文阐述了昆虫细胞扩P1转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染的具体操作步骤与实验体系，同时附有一些我们整理的提高质粒转染效率的注意事项，供大家参考。
1、昆虫细胞扩P1转染：（1）取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞铺六孔板，90万/孔；（2） 27°静置培养30 min,待完全贴壁后进行转染；（3）转染体系注：转染过程中一个实验一个滤器一个离心管，完全独立，避免交叉污染；质粒室温预热，转染试剂和培养基37度预热3、ExpiCHO细胞转染：（1）前一天取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞稀释至3-4 x10^6个/ml；（2）转染当天细胞计数7-9 x10^6个/ml细胞状态良好，活力98%以上,将细胞稀释至6 x10^6个/ml；（3）转染体系（3）.细胞种类不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。
如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。
（4）DNA纯度在制备高纯度质粒时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）, A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右①内毒素小于0.128 eu/ug②质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠③质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染（5）.转染试剂转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。
6分钟提取质粒
6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。
提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。
以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。
2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。
3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。
4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。
5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。
6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。
7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。
8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。
9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。
10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。
这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。
实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。
质粒的转化及转染
质粒的转化转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。
这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种；转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。
质粒转化的目的：将质粒转入细菌内以便获得更多的质粒，达到扩增的目的。
1、从－80℃冰箱中取出感受态的细菌在冰上融化。
（感受态下的细菌更容易接受外源性的DNA）2、打开大实验室（千万不可拿进细胞房，天敌）的细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min。
3、打开水浴锅加热，温度设置为42℃。
4、取若干EP管，标记后，每EP管中加入50μL的菌液。
如質粒難抽，則加大用量。
5、每EP管加入2.5μL的质粒后打匀，动作要轻柔，感受态细菌比较脆弱。
6、将EP管放在冰上孵育25min。
7、将EP管插入浮萍放入42℃水浴锅加热60s（要求时间绝对精确）。
8、将EP管插入冰块90s。
9、每EP管加入1ml细菌培养基后放入大摇床上摇45min（大摇床带有加热功能，温度为37℃）。
10、将Amp细菌培养板（培养基预先加入Amp）放入细菌培养箱中加热至37℃。
11、将枪头预先折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上。
（每盘100μ）12、待液体稍干后将细菌培养板倒置放入细菌培养箱中12—16h。
（过夜）（倒置的目的是为了液体影响细菌生长，另外液体影响观察单克隆体）Amp青霉素（氨苄青霉素Ampicillin）：目的并不是为了灭菌，Amp本身就是抗生素，而是用它来筛菌。
是一种抗生素。
为广谱半合成青霉素，毒性极低。
抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。
对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。
对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。
对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。
质粒转化的方案
质粒转化的方案引言质粒转化是基因工程领域中重要的实验操作之一，其通过将外源DNA片段导入到宿主细胞中，实现基因的转移和表达。
本文将介绍常用的质粒转化的方案和操作步骤。
实验材料和试剂1.质粒：包含所需目标基因的质粒DNA。
2.宿主细胞：常用的宿主细胞包括大肠杆菌（Escherichia coli）和酵母菌等。
3.培养基：常用的培养基包括LB培养基、YPD培养基等。
4.抗生素：如氨苄青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）等，用于筛选转化成功的细胞。
质粒转化的方案和操作步骤1.培养宿主细胞：首先，将宿主细胞在适当的培养基中进行预培养。
预培养条件根据具体宿主细胞的要求确定，通常在摇床上以适当的温度和转速下培养数小时至过夜，直至细胞密度达到一定程度。
2.质粒提取：根据质粒的来源和特性，选择适当的质粒提取方法，如酚/氯仿法、牛奶法等，提取纯度较高的质粒DNA。
3.质粒线性化：某些情况下，需要将质粒进行线性化处理，以利于后续的转化操作。
线性化方法包括酶切、PCR引物设计等。
4.转化操作步骤：–准备转化溶液：将适当体积的质粒DNA、宿主细胞和转化缓冲液等混合，制备转化溶液。
–加入质粒：将质粒DNA加入转化溶液中，使其与宿主细胞充分接触。
–瞬间热冲击法（Heat shock method）：将转化溶液置于冰上静置一段时间，然后迅速在42°C水浴中热冲击数秒钟，最后再将其置于冰上冷却。
–恢复培养：将转化溶液转移至含有适当抗生素的培养基中，恢复培养。
培养条件根据宿主细胞的具体要求确定。
5.筛选转化细胞：在含有适当抗生素的培养基上培养转化细胞，筛选出抗生素耐受的细胞落。
6.鉴定转化是否成功：–酶切鉴定：将转化菌株提取的质粒进行酶切，利用酶切产生的DNA片段大小进行鉴定。
–PCR检测：利用特异引物进行PCR扩增，检测所需目标基因的存在与否。
–DNA测序：进行基因测序，验证质粒是否正确构建。
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解小灵子，我，即将毕业的医学研三狗，分享一下从师姐以及大神那里学来的提质粒方法，第一次做，算比较成功，虽然其中过程非常曲折。
中间问了身边好多同学，都不是很会，研一上课的时候学实验，老师也只是简单讲了一下提纯的步骤，所以我这个科研小白还是打算来和大家分享一下，希望对有需要的同学有所帮助，也希望大家能够多多交流，万一有大神指点呢！Day1第一天最重要的是什么！当然是准备工作！准备工作1. 配液体 LB（这个东西我们这么叫，但是同科室专门做菌的小姐姐管它叫脑心脊液，也是我比较困惑的一点）蛋白胨 10g，酵母 7.5g，NaCl15g，去离子水定容到1000ml ——actually，用不了那么多，两个样最多用300ml，剩下的近期没有其他人用，扔掉我们还很心痛，所以暂时还放在我们4℃ 冰箱里保存着呜呜呜——所以，如果没有那么多样品的话，建议可以按比例减掉的哟！2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去离子水（当然一次就用一点点，也可以按比例递减的）不过没用完，没结晶的话以后也可以用。
3. 配固体培养基：蛋白胨 1g ，酵母 0.5g， NaCl 1g ，琼脂1g，去离子水定容到 100ml。
4. 玻璃珠（这个是涂我们的小菌菌用的，我觉得用接种环、干净的棉签、小木棍都可以，实验室有啥用啥，能省就省！）5. 一套枪头（作为科研狗就别问我一套枪头是什么意思了！）6. 玻璃培养皿 (讲道理，塑料的10cm皿也可以)。
7. 离心管（ 15ml 的多来点！）8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就够了）9. 配抗生素：Ampicillin ：工作液100μg/ml ,可以先配成100μg/μl ,用时1:1000Kanamycin ：工作液25μg/ml ,可以先配成25μg/μl ,用时1:1000（不一定每个质粒都一样哦，记得看它带来的说明书）PS：固体培养基先不要高压，凉了就凝了！其他的速度高压，烘干放在超净台里等待我们接下来的实验hiahia~步骤一：摇菌将大肠杆菌（一点就够~具体我反正是加了10μl ）3~4ml LB 培养基中，37℃ 过夜，剧烈摇晃~ 150-200r 就可以啦。
质粒提取和纯化及质粒转染所需试剂及操作规范
二、质粒的提取和纯化所需1. 液体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容（2）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于4度保存备用，使用时恢复室温（3）配液体LB培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜4度保存），因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中），由于加入的琼脂粉有一定的体积，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的LB中加入加琼脂粉1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子15min，点燃酒精灯。
若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效），根据比例加入抗生素后在铺板。
培养基铺到平板上，每个平板约25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约15min）（5）待LB培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到4℃保存备用3. 配置含有抗生素的LB培养基Amp配制时一般为100μg/μl,使用时稀释1000倍Kana配制时一般为50mg/ml，使用时稀释1000倍二、质粒转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为90-95%的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
双荧光穿梭质粒系统的具体流程
双荧光穿梭质粒系统的具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在开展双荧光穿梭质粒系统的相关工作之前，需要做好充分的准备。
转化 转染 质粒提取等步骤
转化步骤1.取5μl的连接产物到1.5ml离心管中，放置于冰盒中，余下连接产物放回4°C冰箱保存。
2.从-70°C冰箱中取出trans-5α感受态细胞转化菌种，迅速放置于冰盒上，在冰上解冻，待到感受态细胞刚刚融化，取50μl加入到盛有连接产物的离心管中。
3.轻柔晃动离心管，冰上放置30 min。
4.在42℃水浴锅中热激45s，立刻放置于冰上2 min。
5.提前将超净台紫外灯打开，杀菌15min。
6.在超净台中往盛有热激过的感受态细胞的离心管中加入500μl LB培养基，209转/min,37℃摇床培养一个半小时至离心管中液体呈现雾状。
PEI（聚乙烯亚胺）转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、加入100ul OPTI-MEM于1.5ml 离心管中；5、加入质粒DNA，混匀；6、加入PEI（DNA：PEI=1（ug）：2（ul）），立即混匀（一定要马上混匀）；7、室温静置15min；8、向离心管中补加opti-MEM至1ml；9、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；10、4h 后，向细胞培养皿中补加1ml 含20%FBS 无PS的培养基；11、37℃5%CO2培养箱培养24h。
Lipo2000转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、取1个1.5ml离心管，标注为lipo2000，加入200ulOPTI-MEM，及适量lipo2000（DNA：lipo2000=1（ug）：2.5（ul）），室温放置5min（注意：lipo2000加到液面以下，不能加到壁上）；5、质粒及lipo2000混合，混匀，室温放置20min；6、追加opti-MEM至1ml；7、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；8、4-6h 后，更换DMEM+10%FBS培养基（不含PS）；碱裂解法提质粒1.取检验正确的PCR管对应的试管，提取质粒。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序；一、感受态细菌制备（CaCl2法）；1.从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种；2.取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50m；3.将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中；4.4℃条件下，4000r/min离心10分钟，；5.每管加入预冷的0.1mol/lCaCl2溶液；6.冰上放置10min后，4℃条件下质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10m in，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mo l/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
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质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一、感受态细菌制备（CaCl2法）
1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，
4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置
1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；
4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。
5. 选择性培养基：培养基+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素（Amp）即100ml
LB加入100μl Amp(Amp终浓度达到50μg/ml），摇匀后铺板（20ml/板）上盖稍打开，37度烘箱/室温下放置干燥1-2天，封口膜包裹后贮4℃保存备用。
三、质粒转化
注意：取两管感受态细胞①：为空白对照，不加质粒②：加入质粒；
每管加入量：体积<10μl，DNA<50ng；
质粒稀释成0.02μg/μl；
200μl感受态细胞中加入2μl浓度为0.02μg/μl质粒。
具体步骤：
1. 取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42℃
管①空白对照，不加质粒；
管②加入2μl 0.02μg/μl的质粒，混匀，冰上放置30min
2. 42℃水浴90s，不摇
3. 取出，置冰上2min，加入LB 300μl，37℃，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。
同时将选择性培养基置于室温1小时。
4. 取上述转化菌液150μl涂布在相应的培养板上：
⑴不含Amp的培养板——不含质粒菌液⑵含Amp的培养板—a：不加质粒菌液；b：加质粒菌液
正面培养1h后，倒置培养过夜。
5. 观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5ml LB液体培养基中（加入Amp 5ul），37℃培养12h。
6. 用含甘油30%的LB保存，-70℃备用（甘油消毒、高压灭菌）。
三、质粒提取
1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37℃恒温箱中摇菌过夜。
2. 将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。
同时取10mlP1溶液加入10μl的酶抑制剂，备用。
3. 在每个离心管中加入1mlP1：酶抑制剂（1：1），吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。
4. 加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。
放置4分钟。
一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。
Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。
5. 加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。
冰上孵育20分钟。
加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,细胞碎屑和SDS
6. 13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。
吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。
7. 待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。
8. 用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。
9. 加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13000r/min，30分钟。
可见沉淀物，小心弃去上清。
10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后转入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，转入1.5ml的appendorf管。
11. 14600r/min，20分钟，弃上清，待乙醇蒸发后加入100μlTE，再将两管集合（酌量，若质粒量比较多，可加入200μl）。
12. 取2μl质粒液至加有98μl双蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外——分光光度计上检测质粒浓度和纯度。
（纯度参照：1.8~2.0）
13. 剩余的质粒标记日期，质粒种类，浓度放在-20℃冰箱保存，备用。
四、细胞转染
1. 细胞计数后按一定数量植入24孔板中，放入培养箱中培养12小时，备用。
2. 根据转染的孔数及每孔加入的质粒量算出所需的pbs量和质粒量
3. 在两个10ml的离心管中均加入pbs液，A管加入质粒，B管加入转染试剂，吹打混匀。
4. 在斡旋的条件下将转染试剂逐滴加入到质粒中，放置20分钟。
5. 将加过转染试剂的质粒均匀加到已培养12小时的孔板中。
再将孔板置于培养箱培养。