细胞凋亡形态学观察
细胞凋亡与检测原理
细胞凋亡与检测原理细胞凋亡（apoptosis）是一种由体内分子机制调控的程序性死亡过程。
细胞凋亡对于维持身体健康和发展正常的组织功能至关重要。
它在多种生理和病理过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、免疫监视和应答、细胞数量调节、损伤修复和肿瘤的发展等。
因此，对细胞凋亡的检测与研究对于了解细胞凋亡的机制和应用于治疗疾病具有重要意义。
细胞凋亡的检测可以通过多种方法和实验手段进行，下面将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法及其原理。
1.形态学检测法：细胞凋亡在形态上表现为细胞体积的缩小、细胞核染色质的凝结、细胞核的畸变和断裂等特征。
这些特征可以通过光学显微镜观察到。
常用的形态学检测方法有苏木精-伊红染色、核小体染色和电镜观察等。
2.核酸染色检测法：细胞凋亡过程中，细胞核内的DNA分子发生明显的断裂和畸变，这可以通过核酸染色荧光探针来检测。
常用的核酸染色方法有荧光染料染色、DNA单断链检测和TUNEL（转移酶介导的末端标记化反应）法等。
TUNEL法是最常用的细胞凋亡检测方法之一，它通过用荧光标记亲和剂连接到DNA断裂末端的3'-OH基团来检测细胞凋亡的程度。
3. 蛋白质检测法：细胞凋亡过程中，许多蛋白质的表达水平会发生明显变化。
比如，细胞凋亡会导致Bax、Caspase家族蛋白的活化和表达增加，而抑制凋亡的蛋白质Bcl-2则会下调。
因此，通过Western blot 和免疫组化等方法，可以检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平的变化。
4.流式细胞术：流式细胞术是一种通过光电探测器测定细胞数量和特征的方法。
流式细胞术可以通过筛选和排序上述染色体和蛋白质等特征，来确定细胞凋亡发生的程度和类型。
比如，通过测定细胞的细胞质内的卵磷脂翻转（PS）外露与细胞核DNA染色剂（如PI）结合的比例，可以鉴定凋亡细胞和坏死细胞。
细胞凋亡的检测原理是基于细胞凋亡的特征改变。
比如，形态学检测法通过观察细胞的形态学变化来鉴定细胞凋亡；核酸染色检测方法通过检测DNA断裂和畸变来判断细胞凋亡；蛋白质检测法则通过检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平变化来鉴定细胞凋亡。
细胞凋亡形态学观察-V1
细胞凋亡形态学观察-V1
细胞凋亡形态学观察
细胞凋亡是一种自我毁灭的细胞死亡方式，它与多种生理和病理情况
密切相关。
观察细胞凋亡的形态学变化，可以提供诊断和治疗的依据。
以下是细胞凋亡形态学观察的重要内容：
1.细胞体积的减小：细胞凋亡时，细胞体积通常缩小约20%～30%。
这
一变化通常与其他形态学特征一起观察。
2.核的形态学变化：在细胞凋亡早期，核色素凝结成小颗粒，称为
“核染色质凝集”。
接着，核膜破裂，形成许多大约大小相等的、直
径为1～2μm的“核小体”（或“翼状体”）。
最后，核小体被细胞
吞噬或释放到细胞外。
3.胞浆的清晰透明：在细胞凋亡过程中，胞浆变得清晰透明，与正常
细胞的浓稠胞浆形态不同，被称为“凋亡体”。
4.膜凹陷和花环状：在细胞凋亡晚期，胞膜开始凹陷，形成花环状，
最终胞膜破裂，形成凋亡小体，自溶。
以上便是关于细胞凋亡形态学观察的几个重要内容。
通过观察细胞凋
亡的形态学变化，我们可以及时发现病理变化，并进行合理的诊断和
治疗。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
细胞凋亡过程中细胞的形态学变化阶段
细胞凋亡过程中细胞的形态学变化阶段
细胞凋亡是一种程序性死亡方式，是维持机体内稳态的一种重要方式。
在细胞凋亡过程中，细胞会经历一系列形态学变化，这些变化可以分为几个阶段。
第一阶段：细胞收缩
在细胞凋亡的初期阶段，细胞会出现收缩的现象。
细胞体积减小，胞浆变得致密，细胞核也开始变得浓缩。
这种收缩是由于细胞内部发生了一系列的生化变化，导致细胞内部的骨架蛋白发生重组，细胞的结构逐渐改变。
第二阶段：细胞核凝集
随着凋亡的进行，细胞核会出现凝集的现象。
细胞核内的染色质开始凝聚成块状，核膜也开始破裂。
在这个阶段，细胞核的形态会发生明显的改变，呈现出不规则的形状，与正常的细胞核形态有明显区别。
第三阶段：细胞膜凹陷
在细胞凋亡的后期阶段，细胞膜会出现凹陷的现象。
细胞表面会形成凹陷或者泡状结构，最终导致细胞膜破裂。
这种凹陷的现象是由于细胞内部发生了一系列的酶促反应，导致细胞膜的脂质双层结构发生破坏。
第四阶段：细胞碎裂
在细胞凋亡的最终阶段，细胞会发生碎裂的现象。
细胞内部的成分会被分解成小片段，形成称为“凋亡小体”的结构。
这些小片段最终会被吞噬细胞摄取，完成整个凋亡过程。
细胞凋亡过程中的形态学变化阶段可以清晰地反映出细胞内部发生的生化变化。
通过对这些形态学变化的观察，科研人员可以更深入地了解细胞凋亡的机制，为相关疾病的治疗提供参考。
同时，对细胞凋亡过程的研究也有助于揭示机体内部细胞生存与死亡的平衡机制，为未来的生命科学研究提供重要的参考价值。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。
通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。
此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。
如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。
需结合其它的方法来检测细胞凋亡。
)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。
因此，对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。
在本文中，我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，以及它们的优缺点和适用范围。
1. 形态学观察法。
形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。
通过光学显微镜观察细胞形态的变化，如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等，来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法简单直观，但不适用于高通量检测和定量分析。
2. DNA断裂检测法。
DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征，因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。
常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。
这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析，但需要特殊仪器和试剂，操作较为复杂。
3. 蛋白质检测法。
细胞凋亡过程中，一些特定的蛋白质会发生变化，如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。
因此，可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。
常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。
这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势，但需要特异性抗体和专门仪器。
4. 细胞色素C释放检测法。
在细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性增加，导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。
因此，可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。
常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。
这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。
综上所述，不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点，研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。
随着生物技术的发展，新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现，相信在不久的将来，会有更多更简便、灵敏的方法问世，为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。
细胞凋亡的检测原理
细胞凋亡的检测原理
细胞凋亡的检测原理主要包括：
1. 形态学观察：细胞凋亡时，通常会出现一系列形态学的变化，如细胞核染色质凝聚、胞质收缩、细胞核碎裂等。
通过显微镜观察细胞形态的变化，可以初步判断细胞是否经历了凋亡过程。
2. 细胞凋亡标记物检测：细胞凋亡过程中，常常会出现一些特定的生物标记物的改变，如细胞膜外翻的磷脂，如磷脂血小板活化因子（phosphatidylserine，PS）；细胞核内特异性酶活性
的改变，如DNA酶（DNAse）的活化；细胞质内特定蛋白的
表达和位置改变等。
利用这些特定标记物的改变，可以通过免疫荧光染色、荧光探针标记等方法来检测凋亡细胞的存在和数量。
3. DNA断裂检测：细胞凋亡时，DNA会发生断裂并形成大小
不等的DNA片段。
传统的DNA断裂检测方法包括DNA凝胶
电泳和TUNEL反应。
其中，DNA凝胶电泳是通过电泳将
DNA片段按照大小分离，从而检测细胞凋亡的存在和程度；TUNEL反应则是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记
的核苷酸与DNA断裂端连接，通过荧光或酶标反应来检测凋
亡细胞。
4. 细胞凋亡相关蛋白的检测：细胞凋亡过程中，会有一系列蛋白质的变化。
常用的检测方法包括Western blot和流式细胞术。
通过检测细胞凋亡相关蛋白如caspase家族蛋白（caspase-3、caspase-8等）的表达或活性变化，可以间接判断细胞是否发
生凋亡。
综上所述，通过观察细胞的形态变化、检测细胞凋亡标记物的
改变、DNA断裂以及细胞凋亡相关蛋白的表达和活性变化等多种方法，可以对细胞凋亡进行检测和判断。
细胞凋亡的形态实验报告
一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征，了解细胞凋亡的发生过程，为细胞凋亡的研究提供形态学依据。
二、实验材料1. 细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞）；2. 试剂：H2O2（双氧水）、Annexin V-FITC、PI（碘化丙啶）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液；3. 仪器：倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时，进行实验处理。
2. 实验分组：（1）正常组：不做任何处理，作为对照组；（2）凋亡组：加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。
3. 细胞染色：（1）Annexin V-FITC/PI双重染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟；（2）H.E染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入H.E染色液，室温避光孵育15分钟。
4. 细胞观察：（1）荧光显微镜观察：用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征，包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等；（2）流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
5. 数据分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。
四、实验结果1. 荧光显微镜观察：凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征，与对照组相比，凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。
2. 流式细胞仪检测：凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），约为对照组的2倍。
五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，具有形态学特征，如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。
本实验中，凋亡组细胞出现这些形态特征，表明细胞凋亡已发生。
2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，可以检测细胞凋亡率。
细胞凋亡的形态学特征
细胞凋亡的形态学特征
（1）凋亡起始：该时期特征主要为：①骨架杂乱，细胞间接触消失，细胞间粘附力下降；②细胞质和核浓缩，显微镜下观察可发现细胞膜发泡，染色质凝集，沿着核膜形成新月形帽状结构；③内质网腔膨胀，核糖体从内质网上脱落，伴随着这些变化凋亡小体逐渐形成。
（2）凋亡小体形成：随着细胞膜内折，染色质断裂成片断，染色质片断及线粒体等细胞器反折的细胞膜包围并逐渐分开，形成单个的凋亡小体。
（3）凋亡小体消失：凋亡小体被邻近的细胞或巨噬细胞识别吞食及消化。
该过程一般较快，从凋亡开始到凋亡小体形成不过几分钟的时间，整个凋亡过程大约持续几个小时。
细胞凋亡的检测方法及原理
七年级春季道德与法治期中考试试卷分析及总结一、引言七年级春季道德与法治期中考试是对学生道德法治知识掌握情况的一次全面检验。
本次考试旨在通过试卷的命题和评测，了解学生在道德观念、法治意识、社会认知等方面的学习情况，为今后的教学提供有针对性的指导。
二、试卷结构分析本次道德与法治期中考试试卷结构清晰，题型多样，包括选择题、填空题、简答题和分析题等。
试卷内容涵盖了七年级上册道德与法治教材的主要知识点，注重对学生基础知识和综合运用能力的考查。
三、考试情况总结1.学生整体表现从整体上看，大部分学生在本次考试中表现良好，能够较为准确地掌握道德法治的基本知识。
在选择题和填空题部分，学生对基础知识的掌握较为扎实；在简答题和分析题部分，学生能够结合所学知识对问题进行较为深入的分析和回答。
1.存在问题及原因分析然而，在考试中也暴露出一些问题。
部分学生对道德法治知识的理解和应用不够深入，难以将所学知识与实际生活相结合；在简答题和分析题部分，部分学生缺乏清晰的思路和准确的表达，导致答案不完整或偏离题意。
这些问题产生的原因主要有以下几点：一是部分学生对道德与法治学科的学习兴趣不高，缺乏学习动力；二是教师在教学过程中未能充分激发学生的学习兴趣，教学方法单一；三是学生缺乏足够的实践机会，难以将理论知识与实际生活相结合；四是学生在平时的学习中缺乏对基础知识的巩固和拓展。
四、改进措施及建议针对以上问题，提出以下改进措施及建议：1.加强基础知识的巩固和拓展，提高学生的道德法治素养。
2.注重实践教学，通过案例分析、角色扮演等方式，将理论知识与实际生活相结合，提高学生的应用能力。
3.采用多种教学方法和手段，激发学生的学习兴趣和积极性，如开展课堂讨论、组织社会实践活动等。
4.加强师生之间的交流和互动，及时了解学生的学习困难和问题，提供有针对性的指导和帮助。
五、结语本次七年级春季道德与法治期中考试试卷分析及总结旨在发现学生学习中的问题和不足，为今后的教学提供有益的参考和借鉴。
细胞凋亡的形态学变化
细胞凋亡的形态学变化细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体发育、免疫调节和疾病发展等过程中起着至关重要的作用。
细胞凋亡的形态学变化是其最早被观察到的特征之一，本文将详细探讨细胞凋亡的形态学变化及其在生物学中的意义。
细胞凋亡的形态学变化主要包括细胞体积缩小、核染色质凝聚和核内核外囊泡形成。
首先，细胞凋亡发生时，细胞体积会明显缩小，称为细胞收缩。
这是由于细胞内的细胞骨架和细胞质骨架发生重组导致的，细胞内的细胞器也会被重新排列。
细胞收缩是细胞凋亡的早期特征之一，它与细胞内的凋亡信号通路的激活有关。
其次，细胞凋亡的形态学变化还包括核染色质的凝聚。
正常情况下，细胞核内的染色质是均匀分布的，但在细胞凋亡过程中，染色质会变得更加浓缩和凝聚。
这是由于细胞凋亡信号通路的激活导致核内的DNA断裂和染色质的重排。
核染色质凝聚是细胞凋亡的一个重要标志，它可以通过核染色质染料如伊红染液或DAPI进行观察和检测。
最后，细胞凋亡的形态学变化还包括核内核外囊泡的形成。
在细胞凋亡过程中，细胞核内和核外会形成许多囊泡，称为凋亡小体。
这些凋亡小体由磷脂和蛋白质组成，它们可以通过电子显微镜观察到。
凋亡小体的形成是细胞凋亡的一个重要步骤，它们可以通过胞吞作用被周围的细胞或巨噬细胞摄取和清除。
细胞凋亡的形态学变化在生物学中具有重要的意义。
首先，它可以通过形态学的观察和分析来鉴定细胞是否发生凋亡。
细胞凋亡的形态学变化是细胞凋亡的早期特征，可以通过显微镜观察到。
其次，细胞凋亡的形态学变化还可以用于研究细胞凋亡的调控机制和信号通路。
通过观察细胞凋亡的形态学变化，可以了解细胞凋亡的发生和进程。
最后，细胞凋亡的形态学变化在疾病的诊断和治疗中也具有重要的价值。
许多疾病如肿瘤和神经退行性疾病都与细胞凋亡的异常有关，通过观察细胞凋亡的形态学变化可以对这些疾病进行诊断和治疗。
综上所述，细胞凋亡的形态学变化是细胞凋亡的重要特征之一，它包括细胞体积缩小、核染色质凝聚和核内核外囊泡形成。
细胞凋亡特征
细胞凋亡特征细胞凋亡是细胞自我死亡的一种程序性过程，是维持机体内部稳态的重要方式之一、与坏死不同，细胞凋亡是一种高度有序的过程，不会引起炎症反应，对机体具有重要的生理和病理意义。
下面将详细介绍细胞凋亡的特征。
1.形态学特征：细胞凋亡过程中，细胞出现一系列的形态学改变。
首先是细胞体积的缩小，细胞变得更加小而紧密，这是与细胞增殖时体积增大的情况相反。
其次是膜的改变，细胞外膜发生翻转，内侧向外的亲疏水性改变导致细胞外膜的凝集。
此外，细胞核也发生了明显的改变，例如核染色质浓缩成边缘性条状，细胞核内的核酸发生降解。
2.DNA降解：在细胞凋亡过程中，DNA发生降解，形成典型的“DNA 梯状条纹”。
这种DNA降解是由内切酶作用于凋亡的细胞核DNA导致的，其中核酸酶一PAN2和PAN3起到了关键的调控作用。
这种特征可以通过凝胶电泳等分子生物学方法检测出来。
3. 线粒体损伤：线粒体是调控凋亡最重要的细胞器之一、在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位降低，线粒体内氧自由基生产增加，导致线粒体功能障碍和损伤。
例如，线粒体内的细胞色素C被释放到胞浆中，与其他蛋白质相互作用形成凋亡体，激活半胱氨酸天冬酶家族的半胱氨酸酶（caspase），从而引发细胞的凋亡。
4. 独特的信号通路：细胞凋亡是一个高度调控的过程，包括多种信号通路的参与。
其中最为重要的是线粒体途径（线粒体引发的凋亡通路）和死亡受体途径（通过细胞膜上的死亡受体激活）。
这两个信号通路最终都会导致caspase的激活，从而引发细胞的凋亡。
5.没有炎症反应：与坏死不同，细胞凋亡不会引起炎症反应。
这是因为细胞凋亡过程中没有胞浆溢出，细胞被清除后不会导致炎症反应的发生。
这是细胞凋亡与炎症性细胞死亡的重要区别。
总之，细胞凋亡是一种高度有序的细胞死亡过程，具有一系列的特征，包括形态学改变、DNA降解、线粒体损伤、独特的信号通路和没有炎症反应等。
对于正常生理过程和疾病的发生发展都具有重要的影响，因此对于细胞凋亡的研究具有重要的意义。
医学细胞死亡检测方法
医学细胞死亡检测方法细胞死亡是细胞周期不可逆的最终过程，它是组织发育、恶性肿瘤治疗和免疫应答等许多生物学过程的重要组成部分。
细胞死亡的检测在病理学、毒理学和药理学等领域具有广泛的应用。
目前，常见的细胞死亡检测方法包括形态学观察、流式细胞术和细胞活力试剂盒等。
首先，形态学观察是最早也是最直观的细胞死亡检测方法之一、通过显微镜观察细胞形态的变化，可以初步判断细胞是否死亡。
常见的形态学观察方法包括背光显微镜观察和染色体形态观察。
背光显微镜观察常用于检测细胞凋亡的典型特征，如细胞体积变小、细胞核坏死、细胞浓缩等。
染色体形态观察则可用于检测细胞坏死的特征，如染色体碎片、染色体凝集等。
其次，流式细胞术是一种高通量、定量化的细胞死亡检测方法。
通过染色技术和流式细胞仪的应用，可以对大量的单个细胞进行分析和排序。
流式细胞术通常用于检测细胞凋亡和细胞坏死的比例，以及细胞各个阶段的比例。
在细胞凋亡检测中，可使用荧光标记染料，如Annexin V-FITC/PI染料，用于检测细胞的外排磷脂酰丝氨酸的暴露和细胞膜的通透性。
在细胞坏死检测中，可使用细胞渗透染料，如7-AAD、PI和SYTOX Green等，用于检测细胞膜的破裂和染料的进入。
最后，细胞活力试剂盒是一种常用的细胞死亡检测方法。
这些试剂盒通常通过特定的酶活性或染料与细胞内的结构或化学物质发生反应，从而间接地反映细胞的存活状态。
常见的细胞活力试剂盒包括细胞酶活性检测试剂盒、细胞色素C释放试剂盒和联苯胺蓝试剂盒等。
细胞酶活性试剂盒通过检测细胞内的特定酶活性，如乳酸脱氢酶、ATP酶和细胞色素酶等，来评估细胞的存活情况。
细胞色素C释放试剂盒可以检测细胞色素C从线粒体释放到胞浆中的程度，进而判断细胞是否发生凋亡。
联苯胺蓝试剂盒可以检测细胞膜的通透性和细胞内ATP含量，用于评估细胞凋亡和坏死状态。
总之，细胞死亡检测在医学领域具有重要的应用价值。
形态学观察、流式细胞术和细胞活力试剂盒等方法可以互相补充，结合使用，以提高细胞死亡检测的准确性和灵敏度。
实验九 凋亡细胞的诱导及形态学观察
2、将细胞悬浮于含有维生素K3溶液中1 h。
3、将细胞液滴在载玻片上，置于光学显微镜下观察。
观察比较经过诱导的和未诱导细胞形态、大小和细胞凋
亡小体的出现，照相并记录实验结果。
4、凋亡细胞的姬姆萨染色：
(1) 细胞悬液于500 r／min离心后，去除上清液后，将细 胞重悬于0.5 ml PBS中。
实验九 凋亡细胞的诱导及形态学观察
一、实验目的
了解细胞凋亡的形态学特征；
学习研究细胞凋亡的方法。
二、实验原理
凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 细胞凋亡晚期可见凋亡小体。而坏死细胞的体积胀大，细
胞膜损坏或裂解成碎片，有时可见呈网状的染色质结构。
使用普通光学显微镜可以直接观察细胞的大小和凋亡小体， 也可用带荷的染料台盼蓝使死细胞着色、活细胞不着色， 或用染核的染料姬姆萨染色后再在光学湿微镜下进行观察。
覆盖涂片，固定1 min，晾干。
(3) 用姬姆萨染液覆盖涂片，染色5 min。 (4) 回收姬姆萨染液（直接倒入姬姆萨染液试剂瓶），剩
余染液用水轻轻洗去。
(5) 用光学显微镜观察细胞核形态。凋亡细胞的染色质浓 缩、并靠近核膜和核着边现象、核膜裂解、染色质分割成 块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
三、实验仪器、材料和试剂
器具：光学显微镜、离心机、倒置显微镜、载玻片。 鱼血红细胞 试剂：磷酸缓冲液(pH 7.2)、姬姆萨染色液、维生素K3溶液
(300 u mol/L)
四、方法与步骤
1、获取鱼血红细胞0.5 ml，在500×g离心3 min，沉淀 用0.5 ml等渗NaCl溶液洗涤细胞2次。
细胞凋亡过程中可观察到系列形态学特征和生化特征讲解
细胞凋亡过程中可观察到系列形态学特征和生化特征。
早期凋亡信号的效应产生于胞内，此时细胞膜保持完整。
MERCK 公司已发展出几种方法以检测凋亡细胞胞内的多种效应，包括：DNA 片段的检测、膜对称性的变化、caspases 激活、以及细胞死亡相关蛋白水平的变化等。
多数检测使用的底物和Marker 适用于绝大多数种类的哺乳动物。
凋亡细胞染色体DNA 以核小体为单位的切割导致细胞不可逆死亡。
可以采用Nucleosome ELISA(货号：QIA25)，对产生的单体及寡聚核DNA 片段进行定量。
核小体的DNA 成分被捕获于酶标板上，使用生物素标记的抗组蛋白抗体检测捕获的核小体数量。
组蛋白-DNA 片段的量反应了一个特定样品中死亡及濒临死亡的细胞的量。
DNA 片段也可通过片段末端标记进行原位检测，MERCK 提供基于TUNEL 方法的试剂盒FragELTM DNA Fragmentation Detection Kits (使用TdT 的，货号QIA33、QIA39；使用Klenow 的，货号QIA21)。
适用于多种动物来源样本（石蜡、冰冻或固定细胞）。
DNA 片段末端标记可通过荧光染料（QIA39）或比色底物（QIA21、QIA33）方法进行检测。
另外，细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。
采用荧光染料进行末端标记的可用流式细胞技术进行定量，其光散射变化也可支持由单一参数得出的结论。
DNA 片段可以从凋亡细胞中分离(Suicide TrackTM DNA ladder Isolation Kit, 货号AM41)并使用琼脂糖电泳进行分析。
约180bp 的多倍寡核小体片段在电泳上呈典型的梯状条带，可进一步证实凋亡的存在。
若使用Pellet Paint Co-Precipitant( 货号69049)，只需室温操作，两分钟即帮助DNA 沉淀更快捷方便。
线粒体膜电位和膜通透性的变化也是凋亡细胞一个重要特点。
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。 ⑤ AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强， 亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形， 核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去， 组织内附近的细胞进行 有丝分裂，合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂：
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜， 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法：
实验十三、放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。 胞吞噬。
凋亡小体
• 生化特征： 生化特征： 内源性核酸内切酶基 因的活化和表达， 因的活化和表达，导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解，得 的有控裂解， 的有控裂解 到的DNA片段的长度 到的 片段的长度 的倍数。 为200bp的倍数。 的倍数
• 4.制片（空气干燥法） 制片（空气干燥法） 制片
取一滴细胞悬液，滴于倾斜放置 一滴细胞悬液， 细胞悬液 的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散， 的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散， 自然干燥。
cover slip
5.染色： 染色： 染色 滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上， 滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上， 铺开染液，置标本于培养皿中， 铺开染液，置标本于培养皿中，室温下 黑暗环境中染色10min，自来水小心冲洗 黑暗环境中染色 ，自来水小心冲洗, 自然晾干（避光）。 自然晾干（避光）。 6.封片及观察： 封片及观察： 封片及观察 在载玻片（ 在载玻片（slide）上滴一滴 ）上滴一滴10%的甘 的甘 油，用镊子小心将贴有细胞的盖玻片盖 在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡， 在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡， 及时于荧光显微镜下观察 于荧光显微镜下观察。 及时于荧光显微镜下观察。
2.程序性死亡 程序性死亡（programmed 程序性死亡 cell death, PCD）
定义：
又称细胞凋亡（ ），细胞在 又称细胞凋亡（apoptosis），细胞在 ）， 一定的生理或者病理条件下按照自身的 程序结束其生存， 程序结束其生存，是细胞接受指令后进 行的主动性死亡， 行的主动性死亡，涉及一系列基因的激 表达和调控。 活、表达和调控。
一、细胞死亡（cell death） 细胞死亡（ ）
细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察
细胞凋亡（apoptosis）的形态学观察细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。
目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。
一、光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。
在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。
在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。
本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。
本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。
检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。
二、视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。
凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。
检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟 30秒作序列摄影，连续24小时。
如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。
三、电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。
凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。
为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。
本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。
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还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细
胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到 较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段 的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很 少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、 染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡 细胞）被吞噬和降解的现象。
检测方法：
获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬 液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式 细胞仪分析。
检测方法：
细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或 Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞 的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡 细胞计数。
二、视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）
本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可 动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观 察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，
成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织 切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色 增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞 常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞 分离，不引起炎症反应。 本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于 改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特 征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本 方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指 标之一。
流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光
射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式 细胞仪的激光束集点时使激光发生散射， 分析散射光可以提供细胞大小及结构的信 息。散射光包括前向散射光和左向角散射 光两种，前向散射光的强度与细胞大小、 体积相产，右向角射光的强度与细胞结构 的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。
一些不典型的改变容易被忽略，在观察时 要特别予以注意。
检测方法：
透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固 定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片， 醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。 扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定， 乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金， 扫描电镜观察。
四、流式细胞技术
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体 间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量 下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可 以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的 Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰， 即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。 根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。 此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的 电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋 白质比例等方法辨认凋亡细胞。
细胞凋亡的形态学观察
细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据
某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树 叶散落般的形态学特征。目前对细胞凋亡 的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的 方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细 胞凋亡的最可靠的方法。
一、光学显微镜观察 凋Βιβλιοθήκη 细胞的主要特征为核染色质致密深染，形
细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、
胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性 发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射 光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映 了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎 裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射 光均减弱。 由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标， 细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散 射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与 荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡 细胞。
胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长， 出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂， 细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑 培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。
检测方法：
收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培 养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像 装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态 改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24 小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃 微镜下观察和摄影。
三、电子显微镜观察
关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜 和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽 描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩， 染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎 裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳
的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。 本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、 设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。