第12章 分光光度分析法

A kbc
吸光度对浓度作图，绘
制标准曲线，然后根据 A
被测试液的吸光度，从 Ax
标准曲线上查得被测物
质的浓度或含量。当测
试样品较多时，利用标 准曲线法比较方便，而 0
cx
c
且误差较小。
3. 仪器 可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
12.4 显色反应与显色条件
12.4.1 分光光度法对显色反应的要求
当溶液浓度c >10-2 mol/L 时，吸光质点间可能 发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 • 故：朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。 • 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物 的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变 化，影响吸光度。
12.3 光度分析的方法和仪器
1. 目视比色法
目视比色法是一种用眼睛辨别颜色深浅， 以确定待测组分含量的方法。一般采用标准 系列法。即在一套等体积的比色管中配置一 系列浓度不同的标准溶液，并按同样的方法 配置待测溶液，待显色反应达平衡后，从管 口垂直向下观察，比较待测溶液与标准系列 中哪一个标准溶液颜色相同，便表明二者浓 度相等。如果待测试液的颜色介于某相邻两 标准溶液之间，则待测试样的含量可取两标 准溶液含量的平均值。
透光度：透过光的强度It与入 射光强度I0之比，用T表示：
T It I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示:
A lg 1 lg I0
T
It
朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年和
1852年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度
及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析
法的理论基础。
坦处作为显色条件。
2.溶液的pH值： 在相同实验条件下，分别测定不同pH
值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线 中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的 pH范围。
3.显色时间与温度： 显色反应一般在室温下进行，有的反应
需加热，应通过实验找出适宜的温度范围.
4.溶剂： 一般尽量采用水相测定.
12.5 仪器测量误差和测量条件
用不同浓度的某种溶液,最大吸收波长也是固定不 变的,说明光的吸收与溶液中物质的结构有关.
其中KMnO4的浓度大小为：a<b<c<d，可见 浓度越大吸收程度也越大，
12.2 光吸收基本定律
设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射 光强度为 It，反射光强度为Ir，则：
I0 = Ia + It + Ir 由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵 消，上式可简化为： I0 = Ia + It
方法的特点 a. 利用自然光，无需特 殊仪器; b. 比较的是吸收光的互 补色光; c. 目测，方法简便，灵 敏度高; d. 准确度低（一般为半 定量）; e. 不可分辨多组分。
2. 吸光光度法
(1) 方法原理
吸光光度法是借助分光光度计测定溶液的吸光
度，根据朗伯-比耳定律确定物质溶液的浓度的方
法。常用的测定方法有比较法和标准曲线法。
将不同波长的单色光依次通过一定的有色溶液， 分别测出对各种波长的光的吸收程度（用A表 示），以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图， 就得到吸收曲线，或者叫做吸收光谱曲线。
右图是四条不同浓度KMnO4溶 A
液的光吸收曲线.可以看出,在 可见光范围内,KMnO4溶液对 波长525nm附近的绿色光有最 大吸收,而对紫色和红色光则吸 收很少.光吸收程度最大处的波 长,称为最大吸收波长,常用λ最大 或λmax表示,任何可见光区内溶 液的颜色主要是由这个数值决 定的.在正常情况下,选
发射光谱
分子振动 近红外吸收光谱
分子振动 红外吸收光谱
分子转动 微波光谱、电子顺 电子自旋 磁共振
可见光是指眼睛能够感觉到的那一小段光，是 电磁波中一个很小的波段（400~750nm）。日常 所见的日光、白炽光，都是由红、橙、黄、绿、 青、蓝、紫七种不同波长的光所组成的复合光。
由不同波长的光组成的光称为复合光。不仅七 种单色光可以混合成白光，两种适当颜色的单色 光按一定强度比例混合也可得到白光。这两种单 色光称为互补色。
再用适当的还原剂将Mo(Ⅵ)还原为Mo(Ⅴ)，即 生成蓝色的磷钼酸。其最大吸收波长（λmax）为 660nm，在一定的浓度范围内，蓝色溶液吸光度与 磷含量成正比。
注意：用这种方法测核酸中磷含量时,必须先将核 酸试样用浓硫酸或高氯酸消化,使有机磷转变为无 机磷酸再显色测量吸光度,由标准曲线求得磷含量.
第12章 分光光度分析法
12.1 概述 12.2 光吸收基本原理 12.3 光度分析的方法和仪器 12.4 显色反应和显色条件 12.5 仪器测量误差和测量条件 12.6 分光光度法的应用
12.1 概述
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方 法称为分光光度分析法，包括比色法和吸光光度法。 主要有:红外、紫外和可见分光光度分析法。
根据这一规律，可以进行多组分的测定及 某些化学反应平衡常数的测定。
4. 摩尔吸光系数k
(1) 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作 为定性鉴定的参数； (2) 不随浓度c和光程长度b的改变而改变.在温度和波长等 条件一定时,k仅与吸收物质本身的性质有关,与待测物浓度 无关; (3) 同一吸收物质在不同波长下的k值是不同的.在最大吸收 波长λmax处的摩尔吸光系数,常以kmax表示.kmax表明了该吸 收物质最大限度的吸光能力.也反映了光度法测定该物质 可能达到的最大灵敏度. (4) kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该 物质的灵敏度越高。 k>105:超高灵敏; k=(6~10)×104 :高灵敏; k<2×104:不灵敏. (5) k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶 液在某一波长下的吸光度。
12.5.3 溶液中共存离子的影响及其消除 1. 共存离子的干扰
（1）共存离子与显色剂生成有色化合物，使测 定结果偏高；
（2）共存离子与被测组分或显色剂生成无色化 合物或发生其它反应，使测定结果偏低；
（3）共存离子本身具有颜色。
2. 共存离子干扰的消除
a. 加入适当的掩蔽剂，b. 控制显色条件，消除 干扰；c. 改变干扰离子的价态；d. 控制测量条 件；e. 采用适当的分离方法将干扰离子分离。
⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处 略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂 空白”(不加试样溶液)作参比溶液；
⑶ 若待测试液在测定波长处有吸收，而显 色剂等在此无吸收，则可用“试样空白”( 不加显色剂)作参比溶液；
⑷ 若显色剂、试液中其它组分在测量波长 处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂 将待测组分掩蔽后再加显色剂溶液，作为 参比溶液。
12.5.1 仪器测量误差
不同的透光度读数,产生的误差大小不同：
A＝－lgT=kbc 微分:－dlgT＝－0.434dlnT = k’dc
两式相除得：
dc/c = （ 0.434 / TlgT ）dT
以有限值表示可得：
Δc/c =（0.434/TlgT）ΔT
浓度测量值的相对误差(Δc/c)不仅与仪器的 透光度误差ΔT 有关,而且与其透光度读数T 的 值也有关.
1. 朗伯定律 -dI=k1Idb 2. 比耳定律 -dlgII=0/kI3=IdKc2b lgI0/I=K4c
3.朗伯-比耳定律 A lg 1 lg I0 kcb
T
It
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度;
b：液层厚度(光程长度),通常以cm为单位;
c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L-1
K是比例常数,与入射光波长,溶液的性质和温度有关.
1. 选择性好：显色剂尽可能不要与溶液中其他共存
离子显色,如果显色则要消除干扰。
2. 灵敏度高。
3. 显色产物应具有固定的组成,符合一定的化学式.
4. 显色产物的化学性质应该稳定。
5. 显色产物与显色剂之间的颜色差别要大。
12.4.2 显色条件
1.显色剂用量：
吸光度A与显色剂用
量 cபைடு நூலகம்的关系曲线如图 所示.选择曲线变化平
(2) 测定方法
a.比较法:比较法是先配制与被测试液浓度相近的
标准溶液cs被测试液cx，在相同条件下显色后，测
其相应的吸光度，分别为As和Ax，根据朗伯—比耳
定律： Ax kbcx
As kbcs
两式相比得：
所以：
cx
Ax As
cs
As Ax
kbcs kbcx
b．标准曲线法: 借助分
光光度计来测量一系列 标准溶液的吸光度，将
光的粒子性：能量来描述，光是由光子流组成，
光子的能量： E = h = h c /
(Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S )
下表所示为各种频率及波长的电磁波谱。
区域 X射线
频率/Hz 1020~1016
远紫外
1016~1015
紫外 可见 近红外 红外
1015~7.5×1014 7.5×1014~4.0×1014 4.0×1014~1.2×1014
12.5.2 测定条件的选择 1. 选择入射光波长 一般应该选择λmax为入射光波长.
如果λmax处有共存组分干扰时， 则应考虑选择灵敏度稍低但能避 免干扰的入射光波长。
2. 选择合适的参比溶液 参比溶液的选择一般
遵循以下原则：
⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处 有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水) 作参比溶液；
最佳读数范围与最佳值
设：ΔT =1%，则可绘出溶液 浓度相对误差Δc/c与其透光度T 的关系曲线。如图所示：
当：ΔT =1%，T 在15%～ 65%之间时，浓度相对误差较 小，最佳读数范围。
用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在 T %=15～65% (吸光度 A =0.80～0.20)。
可求出浓度相对误差最小时的透光度 Tmin为： Tmin＝36.8%, Amin＝0.434
12.6 分光光度法应用 12.6.1 核酸的测定（定磷法）
核酸中含有磷,利用分光光度法测定核酸中磷的 含量,再推算出核酸的含量.常用的定磷法是钼蓝法. 在酸性介质中,磷酸与钼酸铵反应生成磷钼酸铵:
H3PO4 12(NH4 )2 MoO4 21HNO3
(NH4 )3 PO4 12MoO3 21NH4NO3 12H2O
5. 偏离朗伯-比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标
准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时）， 这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。
引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。
（1）物理性因素
难以获得真正的纯单色光。 朗-比耳定律的前提条件之一是入射光为单
12.1.1 分光光度法的特点
a.灵敏度高； b.准确度高； c.应用广泛；
d.仪器简单、操作方便、快速。
主要用于测定试样中的微量组分。 12.1.2 溶液颜色与光吸收的关系 光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的波动性：波长、频率、光速c、波数(cm-1) 等参数来描述 = c ； 波数 = 1/ = /c
应用朗伯－比耳定律时应注意：（1）朗伯 -比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于 其他均匀非散射的吸光物质（包括液体、气 体和固体）；（2）该定律应用于单色光，既 适用于可见光，也适用于红外光和紫外光， 是各类吸光光度法的定量依据；（3）吸光度 具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸 光物质的吸光度之和。
色光.分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光 带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的正或负 偏离。
非单色光、杂散光、非平行 入射光都会引起对朗伯—比耳 定律的偏离，最主要的是非单 色光作为入射光引起的偏离。
(2) 化学性因素
• 朗-比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不 发生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L) 时才基本符合。
红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围 2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 200400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和 定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 400750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。
本章主要学习紫外可见分光光度法。
1.2×1014~1011
微波
1011~108
波长
10-3~10nm
10~200nm 200~400nm 400~750nm 0.75~2.5μm 2.5~1000μm
0.1~100
跃迁类型
光波类型
X射线吸收、发射、 内层电子跃迁 衍射、荧光光谱、
光电子能谱
远紫外吸收光谱、 价电子和非 光电子能谱 键电子跃迁 紫外-可见吸收和