体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂

3.2.5 体外抗氧化实验
发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用
利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：
()
%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)
式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10
mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光
度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10
mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：
1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，
不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精
准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精
准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、
测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用
DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以无水乙醇为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率：
()
%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (2)
式中A 对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 无水乙醇补充
体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检
样品后的无DPPH·的反应体系的吸光度（用3mL 无水乙醇补充体积）。

上述是针对那些遇酒精不浑浊的情况
注意事项：
1、 本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个
比色皿要一致。

石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”；玻璃比色皿要
么什么都不写，要么写着 “G ”。

如果样品遇到酒精大量浑浊，则
DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以纯水为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率：
()
%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (2)
式中A
对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 纯水补充体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样
品后的无DPPH·的反应体系的吸光度（用3mL 纯水补充体积）。

（3）对羟自由基的清除作用
在一系列50 mL 具塞试管中加入0.8 mL 的HAc—NaAc 缓冲溶液
(0.2mol/L,pH=5.0)，1.0 mL 的孔雀绿溶液(100mL,纯水配制，1×10-4 mol·L -1)，2.2 mL 的EDTA—Fe 2+溶液(2×10-2 mol·L -1,注意不要吸入底部沉淀，沉淀太多则滤纸过滤后使用，以防止不均匀)，1.4 mL 的H 2O 2溶液(体积分数为0.3%，每次用新的，不超过一个月)，用去离子水稀释到10 mL 并涡旋振荡混匀，放置45 min 后，在617 nm 下测定其吸光度A b ，同时测定不加H 2O 2时体系在617 nm 下的吸光度如A 0，则羟自由基的产生量△A=A 0-A b 。

△A 越大，表示生成的羟自由基越多。

上述体系中加入H 2O 2之前放1 mL 待测样品，测定其吸光度A s ，则羟自由基清除率可按下式计算：
清除率=(As0−As )−Ab A0−Ab ×100%
(3)
式中A s0为加入待测样品后未加H 2O 2的反应体系的吸光度。

注意事项：
1、 本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个
比色皿要一致。

石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”；玻璃比色皿要
么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、
H 2O 2 要稀释十倍再使用，母液是3%的尽量用新买的双氧水。

3、 EDTA -Fe2+溶液有浑浊和沉淀，影响实验效果，配置后，立即一层
滤纸过滤，用滤液测定，每次测定时注意底部有无沉淀，和结晶析
出，如有，请过滤后使用，以保证每个试验点的试剂是均一的。

4、
孔雀绿溶液按需配置，因为含铜离子。

5、 注意每一试验管的最后体积为10ml ，由于先加的在试管底部，后加
在试管顶部，为混合均匀，请用涡旋振荡器涡旋振荡试管，确保肉
眼看到上下颜色均一。

设计实验时请计算好要补充的水的体积，打
印或抄写好。

养成好习惯。

6、 每天的实验都要测定1%Vc 的祛自由基效果，以便于横向和纵向比
较。