乳腺上皮细胞原代培养
牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定
牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定崔新洁;王婷;刘秉春;陶林;王潇【摘要】旨在建立简便、经济、纯净的牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,并对所培养细胞进行鉴定.以新鲜牛奶为材料,离心收集细胞进行原代培养并传代,通过测定生长曲线、乳腺上皮细胞骨架蛋白-角蛋白8和18、β-酪蛋白、核型等对所培养细胞进行鉴定,以确定其为乳腺上皮细胞.离心收集到的细胞原代培养3d后形成多个单克隆,细胞呈典型的铺路石状,同时伴随少量的吞噬细胞,继续培养至单克隆汇合时,细胞表层产生大小不等的乳滴,吞噬细胞大多转移到乳滴中,传代后,得到纯净的乳腺上皮细胞,吞噬细胞随传代而消失;细胞生长曲线呈“S”型,RT-PCR法扩增到了乳腺上皮细胞的骨架蛋白8、18以及β-酪蛋白,细胞免疫组化检测到了细胞角蛋白8,核型为29对端着丝粒常染色体,1对近端着丝粒性染色体.通过以上试验证明,乳汁分离法可以培养纯净的、具有正常分裂增生能力的牛乳腺上皮细胞,建立了乳腺上皮细胞的体外培养模型.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】7页(P107-113)【关键词】乳汁;牛乳腺上皮细胞;细胞骨架蛋白;泌乳【作者】崔新洁;王婷;刘秉春;陶林;王潇【作者单位】内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特010010【正文语种】中文在奶牛乳腺炎的发病过程中,乳腺上皮细胞是与外界直接相通的细胞,乳腺上皮细胞上含有模式识别受体TLR,对机体的先天性免疫具有重要的作用。
除此之外,乳腺上皮细胞最重要的功能是泌乳。
因此建立简便、经济、纯净的乳腺上皮细胞的体外培养模型,对病原免疫学以及泌乳机制的研究都具有重要的意义。
1961年,Ebner等[1]第一次将乳腺上皮细胞在体外培养至30-40代,但是,随着传代次数的增加,大多数上皮细胞失去原有的特性,而表现成纤维细胞的特性。
之后多种方法被采用,以去除成纤维细胞的污染,如在培养液中添加D-缬氨酸以选择性地去除成纤维细胞,或密度梯度离心法,或胶原酶与胰酶共同消化法等[2-10],但随着传代的进行,都不同程度地混有成纤维细胞的污染。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》范文
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展,细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。
其中,原代培养技术是获取特定组织或器官细胞并进行研究的关键步骤。
奶牛作为重要的畜牧业资源,其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定对于研究奶牛乳腺疾病、提高奶牛养殖效益具有重要意义。
本文旨在介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定技术,为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料(1)奶牛乳腺组织样本:采集自健康奶牛的乳腺组织。
(2)实验试剂与器材:包括胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM 培养基、离心管、培养瓶等。
2. 方法(1)原代培养a. 乳腺组织处理:将采集的乳腺组织清洗干净,剪成小块。
b. 酶消化法:用胰蛋白酶对组织进行消化,获得单细胞悬液。
c. 细胞接种与培养:将单细胞悬液接种于培养瓶中,加入适量培养基,置于培养箱中培养。
(2)细胞鉴定a. 形态学鉴定:通过倒置显微镜观察细胞形态。
b. 免疫组化鉴定:利用特异性抗体对细胞进行免疫组化染色,鉴定细胞类型。
c. 分子生物学鉴定:通过PCR、Western Blot等技术鉴定细胞基因及蛋白表达情况。
三、实验结果1. 原代培养结果(1)乳腺上皮细胞培养:培养一定时间后,可观察到细胞贴壁生长,形成单层上皮样结构。
(2)成纤维细胞培养:成纤维细胞生长迅速,呈梭形或多角形,排列紧密。
2. 细胞鉴定结果(1)形态学鉴定:乳腺上皮细胞呈圆形或卵圆形,成纤维细胞呈梭形或多角形。
(2)免疫组化鉴定:通过特异性抗体染色,可观察到乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特征性表达。
(3)分子生物学鉴定:PCR、Western Blot等技术鉴定结果显示,乳腺上皮细胞和成纤维细胞的基因及蛋白表达情况与文献报道相符。
四、讨论本实验成功建立了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养体系,并通过形态学、免疫组化及分子生物学等方法对培养的细胞进行了鉴定。
奶牛乳腺上皮细胞系的建立
文献标识码:A
文章编号:0366—6964(2009)05-0743—05
Establishment of Dairy Cow Mammary Gland Epithelial Cell Line
CHEN Jian-hui,TONG Hui—li,LI Qing-zhang,GAO Xue-iun’ (Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,
应用免疫荧光细胞染色法检测纯化后乳腺上皮 细胞角蛋白18的表达情况,激光共聚焦显微镜下观 察,一抗染细胞角蛋白,PI染核,细胞中的角蛋白18 染成绿色,细胞核染为红色,方法参考文献[9]。 1.7奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测
根据每天对细胞生长情况的观察,记录奶牛乳 腺上皮细胞的生长特性和细胞形态的差异,对乳腺 上皮细胞做生物学性状的检测。细胞形态学观察、
根据成纤维细胞和乳腺}皮细胞对胰蛋白酶的 敏感性不同,可得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞(图 l-C)和纯化的成纤维细胞(图卜D)。 2.3奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
应用激光共聚焦显微镜观察,结果显示分离培 养的乳腺上皮细胞角蛋白18的表达呈阳性(图2, 图3)。 2.4奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测 2.4.1 细胞形态学观察 在细胞进行传代过程中, 出现了不规则的多边形奶牛乳腺上皮细胞(图1一 E)、长形乳腺上皮细胞(图1一F)、蜂窝状的乳腺上皮 细胞(图l-G)、圆顶型的乳腺上皮细胞(图1一H)、含 有丰富乳滴的乳腺上皮细胞(图1-I,1一J)和细胞出 现含有2~6个核仁的乳腺上皮细胞(图1-K)、拉网 结构的乳腺上皮细胞(图卜L)、岛屿状的乳腺上皮 细胞(图1一M),当细胞生长非常紧密时,出现细胞抑 制现象(图1-N),当细胞传到20代时,细胞为长梭 形(图l一0)。 2.4.2细胞生长曲线 以培养时间为横坐标,3孔 细胞数的平均值为纵坐标绘制奶牛乳腺上皮细胞生 长曲线(图4)。细胞生长曲线显示:奶牛乳腺上皮 细胞生长延迟期为O~5 d,对数生长期为5~9 d,9 d后进入平台期。结果表明,培养的奶牛乳腺上皮 细胞具有正常的分裂增殖特性,符合细胞生长的生 物学规律。 2.4.3细胞接种存活率用对数生长期的细胞,通 过消化法制成细胞悬液,CASY细胞活力分析仪计 数后,按每平皿5.7×105个细胞接种,每组3平皿。 每2 h消化计数1组已贴壁细胞,共观察24 h,分12 次进行。结果表明,细胞贴壁率及存活率在24 h内 逐渐升高,并达到最高值92%以上,说明细胞的生 存及贴壁能力较强(表1)。
奶山羊乳腺上皮细胞系的建立
乳 机制 的研 究提供 体外 研 究的细 胞模 型 。
l 材料与方法 11Fra bibliotek实验材 料 .
培 养 用乳 腺 组 织来 自泌 乳 3 性 乳 房炎 阴 5d隐
性 的健 康关 中奶 山 羊。
细 胞 形 态 为 典 型 的 上 皮 型 ,能 表 达 多 种 角 蛋 白 ,
倍增 时间、细胞接种存 活率、细胞活力检测等 生物 学性状的检 测建立并鉴定 了奶 山羊乳腺上 皮细胞 系。结果表 明,
奶 山羊乳腺上 皮细胞在添加表 皮生长因子 、胰 岛素样 生长因子一 、转铁 蛋白一 1 硒钠 、1%胎牛血清的 D 1 培 养液 0 F2
中生长状 态良好 ,细胞传 至 3 时仍保持 旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反 复冻存和复 苏实现 了细胞 系的长期 O代
收 稿 日期 :2 0 — 7 1 070 —3
L IA ;T P O S激 光 扫描 共 聚 焦 显微 镜 EC ) C S 2A B
( 国 L IA) 德 EC 。 1 . 实验方 法 3
1 . 奶 山羊乳腺上 皮细胞 的原代 、传代培养及纯化 .1 3 乳 房 中部 消毒 ,按照 常规 手术 切取少 量 乳腺组 织 块 ,立 即用 D H ns 清 洗 组 织 块 并 尽 量 剥 离 — ak 液 脂肪 组织 和结缔 组织 ,将 白色颗粒 状 的腺泡 组织 尽 量剪 碎 ,置 于胶 原酶 I 和透 明质 酸 酶 的混 合 消化 液
维普资讯
在 塑 料 皿 上 能 形 成 腔样 结 构 和腺 泡 惮 结 构 ,在 胶
1 试 剂与 设备 . 2
表皮生长因子 、转铁蛋 白一 硒钠 、胰岛素样生
细胞原代培养实验具体步骤及方法
细胞原代培养实验具体步骤及方法将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。
因此,较为严格地说是指成功传代之前的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留二倍体数。
但实际上,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
一、实验材料准备1. Hank's液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至1 000 ml。
Hank's液可以高压灭菌。
4℃下保存。
二、具体操作1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
2. 用Hank's液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块(1 mm2),再用Hank's液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6. 静置5-10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm,离心10分钟,弃上清液。
8. 加入Hank's液5 ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5x105/ml左右,转移至25 ml细胞培养瓶中,37℃下培养。
注意1. 自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。
乳腺上皮细胞体外培养的研究进展
胞 特 性 。 以上 种细 胞 系 均不 表 达 乳 蛋 白 , 能用 不 于泌 乳 相 关研 究 , 他 的一 些 牛 乳 腺上 皮 细 胞 系 可 其 以不 同程 度地 表达 乳蛋 白。 T C、 ME U MA — E — B — V、 C T 这 三种 牛 乳 腺 细胞 系都 是 通 过 转 染 S 4 L A 基 因 V0T 而永 生化 的。 牛乳腺上皮细胞系 B E U M - V可 以表 达低
汁 的功 能 。分 泌上 皮 细胞 在 妊娠 期 分 化 增殖 , 临 在
乳腺 中唯 一具 有 分 泌功 能 的 细胞 , 研 究 乳 腺 泌乳 是 机制 的着 手 点… 。但 事实 上 , 内腺体 组织 整体 和 局 体 部 , 括 细胞 外 基质 ( 包 基质 和 基膜 ) 间充 质 细 胞 等 和
来还 用 于机体 免 疫机 制 的研究[, 。 11 01 1 目前 大 多 数 研 究 主 要 通 过 单 克 隆 培 养 或 猿 猴 病 毒大 片段 T抗 原 基 因 (V 0 T 转染 建立 乳腺 上 S 4 L A) 皮 细胞 系 。单 克 隆 培养 操 作 复 杂 , 养条 件 要 求 严 培
分 泌上 皮 、 管上 皮 和肌 上皮 三者 的混合 培养 , 速 导 差
贴 壁 法 和差 时 消化 法 很难 将 这 三 种上 皮 细 胞分 开 , 只有 经 过 梯 度 离 心 等处 理 方 法 才 可将 其 分 开 。 Z vz n等 (9 6 通 过 淋 巴细胞 分 离 液分 离 得 到 分 ai o i 19 ) 泌 上皮 细胞 , 并转 染 含有猿 猴 病毒 ( V 0 t 5 S 4 ) a 8序列 s
分 化 , 皮 细胞 数 量 较 多 , 上 功能 较 活 跃 , 取 材 的最 是 佳 时期 l 7 _ 。一般 我 们 采用 腺 体 组 织样 品进 行 细胞 分
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是,组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大变化,在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时,原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下,采用原代培养做各种实验,如药物测试、细胞分化等,效果很好。
但应注意,原代培养组织是由多种细胞成分组成的,比较复杂。
即使全为同一类型的细胞,如上皮细胞或成纤维细胞,也仍具有异质性,在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次,由于供体的个体差异及其他一些原因,细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长,即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力,有的细胞类型只是存活而不增殖,而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活,因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下,瓶底全部铺满细胞,达到会合以后,对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长,而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加,天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代,保持细胞低密度生长,有利于保存细胞的正常表型(如小鼠成纤维细胞)。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大,培养基消耗将尽,细胞代谢产物积聚过度,细胞增殖变慢,应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后,需要进行分离培养,否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭,都将影响细胞的生长,这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系,能连续培养下去的为连续细胞系;不能连续培养的为有限细胞系。
通常,传代培养是指扩大培养,也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来,不论稀释与否,将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定
裂出少量的上皮细胞 。培 养 8 d奶 牛乳腺 上皮 细胞迅 速增殖 , 形成 岛屿状 集 落, 呈单层 “ 鹅卵 石” 和“ 铺路石” 形 态生长 。3 ) 奶 牛 乳腺 上 皮 细 胞 角 蛋 白 1 8鉴 定 为 阳性 。4 ) 培 养至 l 0和 2 0代
的奶牛乳腺上皮细胞染 色体数 为 6 0 条, 具有正常的细胞二倍体核型。综上所述 , 采 用组织块培 养细胞能够获得具有稳 定性、 功能性 的奶牛乳腺上皮 细胞 , 但不是永生化 细胞。
司, 细胞 角 蛋 白 1 8单 克 隆 抗 体 、 羊 抗 鼠荧 光 二 抗
购 自S a n t a C r U Z公 司 。
能[ 5 - 8 3 。本 试 验 旨在 对 成 功 培 养 的奶 牛 乳 腺 上 皮 细胞 系 进 行 功 能 验 证 , 为 奶 牛乳 腺 上 皮 细 胞 的 泌
8期
詹
康等 : 奶 牛乳腺上皮 细胞系 的培 养与鉴定 响
1 . 1 试 剂
白的研 究并 无 对 奶 牛乳 腺 上 皮 细胞 的 泌乳 营 养 的
研 究。H u y n h等 利 用 对 温 度 敏 感 的 突 变 体
S V4 0 T抗原 基 因 转 染 原 代 的 牛 乳 腺 细 胞 建 立 了 奶牛乳腺上皮 细胞系 , 该 细 胞 系 保 留 了 上 皮 细 胞 的典 型特 征 , 而 且 在 激 素 的诱 导 下 能 够 分 泌 乳 蛋 白。Z a v i z i o n等 建 立 了 温 度 敏 感 的奶 牛 乳 腺 上
收 稿 日期 : 2 0 1 5 — 0 3 — 0 2
基金项 目: 江苏 省高校优势学科建设工 作资助项 目( P AP D) 作者简 介: 詹 康( 1 9 8 8 一) , 男, 江苏南京人 , 博士研究生 , 从事 动物分子营养研究 。E — ma i l :z h a n k a n g 0 3 0 5 @1 6 3 . c o m 通信作 者 : 赵国琦 , 教授 , 博 士生导师 , E — ma i l : g q z h a o @y z u . e d u . C D
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》范文
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言奶牛作为重要的经济动物,其乳腺细胞和成纤维细胞的研究对于奶牛疾病防治、育种及生理研究等方面具有重要意义。
本文将介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定过程,为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料(1)奶牛乳腺组织样本:从健康奶牛的乳腺中获取。
(2)培养基及试剂:DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等。
(3)实验器材:显微镜、离心机、细胞培养瓶等。
2. 方法(1)细胞原代培养:取新鲜奶牛乳腺组织,经处理后分别分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞,将其接种于培养瓶中,加入适量培养基进行培养。
(2)细胞鉴定:通过观察细胞的形态、生长特性及免疫组化等方法对细胞进行鉴定。
三、实验步骤1. 乳腺组织样本的获取与处理从健康奶牛的乳腺中获取组织样本,用无菌器械将其剪成小块,用PBS缓冲液清洗干净。
2. 乳腺上皮细胞和成纤维细胞的分离与培养(1)将清洗干净的乳腺组织块置于含有胰蛋白酶的离心管中,进行消化处理。
(2)将消化后的组织液离心,收集细胞沉淀,用培养基重悬细胞,接种于细胞培养瓶中。
(3)将培养瓶置于恒温培养箱中,定期观察细胞生长情况,更换培养基。
3. 细胞鉴定(1)形态观察:在显微镜下观察细胞的形态、大小、生长状态等。
(2)免疫组化:利用特定抗体对细胞进行染色,观察细胞的特异性标志物。
四、结果与分析1. 细胞培养结果经过原代培养,成功获得了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的单层生长。
细胞在培养基中生长良好,形态清晰,无污染。
2. 细胞鉴定结果(1)形态观察:乳腺上皮细胞呈扁平多边形,成纤维细胞呈长梭形,两者均具有典型的细胞特性。
(2)免疫组化:通过免疫组化染色,观察到乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特异性标志物,证实了细胞的类型。
五、讨论本文介绍了奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养方法及鉴定过程。
在实验过程中,需要注意无菌操作、细胞分离与纯化、培养条件的控制等方面,以确保实验结果的准确性。
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养,是建立细胞系的第一步,是一项基本技术。
原代细胞因刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反映体内生长特性,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
原代细胞往往有多种细胞组成,比较混杂,即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样),但细胞间仍有很大差异。
如果供体不同,即使组织类型、部位相同,个体差异也照样存在,原代细胞生物特性尚不稳定,如需做较为严格的对比性实验研究,还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法,也是早期采用培养细胞的方法,故原先被称为组织培养。
其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长,方法简便,利于培养,部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出,然后逐渐延伸,长成肉眼可以观察到的生长晕,5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮,此漂浮小块可随换液而弃去,由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片,可在显微镜下观察形态和用于实验研究。
其培养方法如下:(1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块,并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20~30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
原代培养
原代培养(primary culture) 是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。
由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。
利用此方法还可直接服务于临床实践,例如,用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养,然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选,根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案,有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
原代培养可分为消化法和组织块培养法,这里统一作介绍。
一、培养细胞生长的条件1、细胞的营养需要a、基本营养物质:氨基酸、维生素b、促生长因子等物质c、此外激素也可有助于细胞生长培养液(medium):培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。
血清(FBS,FCS,CS,HS)、合成培养基,如:DMEM、RPMI 1640和Ham F12 等。
2、细胞的生存环境a、温度:适宜的温度与取材的动物种类有关b、气相及pH: 5%CO2;pH: 7.2-7.43、无污染及无毒:无毒是培养细胞的必须条件,细菌,病毒,支原体等。
二、培养细胞的生长方式1、贴附生长:必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞2、悬浮生长:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。
各种造血系统肿瘤细胞【实验步骤】一、消化法培养的基本操作1、操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手,手和临时带进无菌室的物品、工具等均用新洁尔灭浸泡消毒2分钟。
2、将胎鼠或新生鼠处死,然后用75%酒精浸泡消毒数秒,迅速带进入无菌室。
3、将胎鼠或新生鼠置超净工作台上,使其背部朝上,用碘酒棉球擦洗背部的被毛,然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
4、在腰部的后缘,用解剖镊提起皮肤,用解剖剪剪开皮肤,用镊子将剪开的皮肤拉向两侧。
用解剖剪剪开背部的肌肉,此时,即可见蚕豆状的肾脏,用镊子取出肾脏,放于无菌的已加入D-Hanks液的培养皿中。
奶牛乳腺上皮细胞系的建立
左右时,少量成纤维细胞开始从组织块周围出现,10d 左右时乳腺上皮细胞开始从组织块周 围生长,单层细胞融合至培养底壁的 90%左右,吸出原有培养液,根据上皮细胞与成纤维 细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同,在混合生长的原代或传代细胞培养物中,经过 0.25%胰蛋 白酶的 D-Hanks 液,37℃消化,在倒置显微镜下观察,待成纤维细胞细胞质回缩,细胞间 隙增大,脱离瓶壁时,加培养液终止消化,将酶液倾出,离心后得到的大部分是成纤维细胞。 3~5 次选择传代,弃掉组织块,可得到纯化的乳腺上皮细胞。
奶牛乳腺上皮细胞系的建立
陈建晖,佟慧丽,高学军﹡,李庆章
东北农业大学动物医学院,哈尔滨(150030)
E-mail:chenjianhui_2005@
摘 要:奶牛乳腺上皮细胞系的建立可为转基因动物生产、提高泌乳量提供良好的动物体外 模型。本研究采用组织块接种法,成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞。通过对细胞接种存活率、 群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺 上皮细胞系,细胞传至 20 代以上时仍保持旺盛的增殖活力。此外,本研究探讨了胰岛素、 催乳素及孕酮对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白和乳糖分泌能力的影响。 关键词:奶牛;乳腺上皮细胞;细胞系 中图分类号:Q2
检测样品的处理和酪蛋白的一样,HPLC 的检测条件:紫外检测波长,195nm;流动相, 5%的乙腈,流速,恒流 0.6ml/min;进样体积,10µl,其他操作同酪蛋白一样。分别以浓度 为 1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml 的乳糖标准品进行 HPLC,以乳糖浓度 为横坐标,峰面积为纵坐标作乳糖标准曲线。细胞样品与乳糖标准品采用完全相同的 HPLC 检测条件。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》范文
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展,细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。
其中,原代培养的细胞因其更接近自然状态下的生理特性,对于研究细胞的功能、机制以及疾病的发生发展等具有重要意义。
本文以奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞为研究对象,对其原代培养及鉴定过程进行详细阐述。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括:新鲜奶牛乳腺组织、成纤维细胞培养基、上皮细胞培养基、胰蛋白酶、EDTA等。
2. 方法(1)奶牛乳腺组织获取及处理:在无菌条件下获取新鲜奶牛乳腺组织,用含有双抗的PBS溶液清洗,去除血液及杂质。
(2)原代培养:将清洗后的乳腺组织剪成小块,用胰蛋白酶和EDTA消化,分别获得乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
将细胞接种于培养瓶中,加入相应培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
(3)细胞鉴定:通过观察细胞的形态、生长速度等,以及利用免疫荧光、PCR等技术对细胞进行鉴定。
三、实验结果1. 细胞形态观察通过显微镜观察,奶牛乳腺上皮细胞呈典型的多边形或梭形,排列紧密;成纤维细胞呈长梭形或星形,具有明显的纤维状突起。
两种细胞的生长速度均较快,且在培养基中生长良好。
2. 免疫荧光鉴定通过免疫荧光技术对细胞进行鉴定,结果显示奶牛乳腺上皮细胞表达上皮细胞特异性标志物E-cadherin,而成纤维细胞则表达成纤维细胞特异性标志物α-SMA。
证明所培养的细胞分别为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
3. PCR鉴定利用PCR技术对细胞的基因进行扩增和鉴定,进一步证实了所培养的细胞类型。
PCR结果显示,奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的基因表达与文献报道相符。
四、讨论原代培养的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞在形态、生长速度等方面均表现出良好的生物学特性。
通过免疫荧光和PCR等技术对细胞进行鉴定,证实了所培养的细胞分别为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
这些原代培养的细胞为研究奶牛乳腺生物学、乳腺疾病的发生发展以及新药研发等领域提供了重要的实验材料。
奶山羊乳腺上皮细胞
犃 犮 狋 犪犞 犲 狋 犲 狉 犻 狀 犪 狉 犻 犪犲 狋犣 狅 狅 狋 犲 犮 犺 狀 犻 犮 犪犛 犻 狀 犻 犮 犪
胰岛素 、 催乳素对奶山羊乳腺上皮细胞 泌乳功能的影响
佟慧丽 ,高学军 ,李庆章 , 严云勤
收稿日期 : 2 0 0 7 0 7 0 3 基金项目 : 东北农业大学创新团队项目 ( ) ; 黑龙江省教育厅高校博士点专项科研基金 ( ) X L T 0 0 5 1 2 HL J B S D J I 2 0 0 4 1 5 作者简介 : 佟慧丽 ( ) , 女, 黑龙江哈尔滨人 , 博士 , 主要从事泌乳生物学与乳腺功能调控研究 , : 1 9 8 0 E m a i l t o n h u i l i 2 0 0 4@1 6 3. c o m g 高学军 , 博士 , 教授 , : E m a i l a o x 5 3 9 0@s i n a . c o m 通讯作者 : g j
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1 . 2 . 2 奶山羊乳腺 上 皮 细 胞 的 激 素 处 理 选 择 对 制成单细胞悬液 , 数生长期的奶山羊乳腺上皮细胞 , 等密度接种 , 待细胞铺满 培 养 血 底 壁 的 7 0% ~8 0% 时, 向含 1 0%F B S的 D F 1 2培养液中添加表皮生长 因子 、 转铁蛋白 硒 钠 和 胰 岛 素 样 生 长 因 子, 以此作 为对照 组 。 在 此 培 养 液 成 分 的 基 础 上 分 别 添 加 5 / / m L 胰岛素 、 5μ m L 催乳素作用于 体外培养 的 g g μ 奶山羊乳腺上皮细胞 。 继续培养 4 8h 后收集细 胞 , 以研究奶山羊乳腺上皮细胞乳脂 、 总蛋白 、 乳糖的分 泌能力 。 1 . 2 . 3 乳腺上皮细胞总蛋白 的 S D S P AG E 电泳 收集不同组分处理后的细胞按照常规电泳技术进行 乳腺上 皮 细 胞 总 蛋 白 的 S D S P AG E。 电 泳 结 束 后 将凝胶置于固定液中固 定 2 , 考马斯亮蓝 0~3 0m i n 将凝胶置于脱色液中脱色1 染色 2~3h, 2~2 4h, 至凝胶背景褪色 、 蛋白质区带清晰为止 , 封胶观察 。 1 . 2 . 4 奶山羊乳 腺 上 皮 细 胞 甘 油 三 酯 含 量 的 测 定 按T G 试剂说明书进行甘油三酯含量 收 集 细 胞, 的测定 。 1 . 2 . 5 奶山羊乳腺上皮细 胞 乳 糖 H P L C 测定 ① 检测样品的处理 : 用流动相溶解不同浓度的乳糖标 用纯水重悬不同处理组细胞 , 置于冰上用匀 准样品 , 浆器机械破碎 细 胞 , 0 . 2 2μ m 滤膜过滤裂解液后用 于乳 糖 的 H 色谱 P L C 检 测。 ② H P L C 检 测 条 件: 十八烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 , 柱温 柱, 4 . 6×2 5 0 mm; Φ 为室温 ; 紫外检测波长 1 流动相 , 超纯水经 过 9 5n m; 超声脱气 ; 恒流 0 / 进 0 . 2 2μ m 滤膜过滤 , . 6m L m i n; 样体积 为 1 0μ L。 ③ 分 别 以 浓 度 为 1、 5、 1 0、 1 5、 2 0 / 以乳糖浓度为横 m L 的乳糖标准品进行 H P L C, m g 坐标 , 峰面积为 纵 坐 标 作 乳 糖 标 准 曲 线 。 细 胞 样 品 与乳糖标准品采用完全相同的 H P L C 检测条件 。 1 3 数据的统计分析 a n d S c a n 4 . 3对 S D S P AG E进行灰度扫 采 用 B 描分析, 采用 S i m a P l o t 9 . 0对有关数据进行统计 g 与 分 析 。 试 验 数 据 经狋检 验 进 行 统 计 学 分 析 。
奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态学观察100305
奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察王秀美 1 考桂兰1高爱武2*侯先志1高民 3(1. 内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特 010018; 2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,呼和浩特 010018;3. 内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010010)摘要:本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104细胞/ml、1×105细胞/ml和1×106细胞/ml。
经过16天培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。
结果表明,当细胞接种浓度为1×104—105细胞/ml时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。
关键词:奶牛乳腺上皮细胞;三维培养;基质1引言乳腺组织的上皮细胞能以血液中各种营养物质为原料,合成并分泌乳汁。
建立可表达泌乳蛋白的乳腺上皮细胞系,能够极大方便乳腺上皮细胞中乳成分基因表达及调控的研究,为进一步研究各种营养因素对泌乳过程的影响奠定基础。
乳腺上皮细胞在体内存在于三维环境中,细胞外广泛分布着胞外基质(extracellular matrix,ECM),它们主要由细胞分泌的蛋白和多糖构成。
胞外基质对细胞形态、生长、凋亡和代谢功能起重要的调控作用,如β-酪蛋白的基因转录就受到激素及细胞与基质相互作用的共同协调[1]。
乳腺上皮细胞在体内基质环境中,形成中空腔状的腺泡结构。
常规的体外细胞培养都是单层培养(二维培养),形成贴壁生长的单层细胞形态。
研究证明,二维生长的人乳腺上皮细胞不能形成腺泡结构,缺失了对生长因子和催乳激素的响应,并且也检测不到分化所产生的蛋白质,如乳清蛋白和β-酪蛋白。
但当它们生长于胞外基质成分中时,就能形成腺泡结构,并对激素信号产生响应[2]。
类似的关于胞外基质信号对上皮细胞生理和生化的影响在其它组织的研究中也得到了证实[3,4,5]。
奶牛乳腺上皮细胞原代培养、纯化及鉴定技术研究进展
奶牛乳腺上皮细胞原代培养、纯化及鉴定技术研究进展林杰;王旭荣;李建喜;王孝武;杨志强【摘要】奶牛乳腺上皮细胞不仅具有合成和分泌乳汁的功能,而且在乳腺的先天免疫中扮演着重要角色,对泌乳机制、乳房炎发病机制的研究,以及药物筛选具有重要意义.原代培养的奶牛乳腺上皮细胞适宜建立细胞模型,可作为生理、病理、药理等方面研究的良好介质,解决体内试验周期长、成本高、个体差异大的难题.作者主要从奶牛乳腺上皮细胞原代培养的发展历程、培养技术、纯化技术及鉴定方法等方面的最新研究情况进行综述,以期为奶牛乳腺上皮细胞培养相关研究提供参考.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)008【总页数】7页(P2109-2115)【关键词】奶牛;乳腺上皮细胞;原代培养;鉴定【作者】林杰;王旭荣;李建喜;王孝武;杨志强【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州730050【正文语种】中文【中图分类】S823乳腺上皮细胞是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞,是实现泌乳的基础,同时也是构成乳腺先天免疫屏障的重要组成部分,故该细胞成为研究泌乳机制、乳房炎发病机制和药物筛选的重要工具。
并且近期研究发现培养的乳腺上皮细胞中存在具有增殖分化能力的乳腺干细胞,具有一定的研究价值,寻找到了乳腺上皮细胞新的研究方向[1]。
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》范文
《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言原代培养技术在细胞生物学及动物医学等领域应用广泛。
针对奶牛这一特殊的物种,了解其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的特性和功能对于奶牛健康管理和乳制品产业具有重大意义。
本文旨在详细介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养过程及其鉴定方法。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的材料包括奶牛新鲜乳腺组织、组织消化液、细胞培养基、胰蛋白酶等。
2. 方法(1)原代培养a. 采集新鲜奶牛乳腺组织,进行清洗和消毒处理。
b. 将组织剪成小块,用组织消化液进行消化处理。
c. 将消化后的组织细胞悬液进行离心,去除上清液,加入细胞培养基进行培养。
(2)细胞鉴定a. 形态学观察:利用显微镜观察细胞的形态和生长情况。
b. 免疫组化染色:通过特异性抗体对细胞进行染色,鉴定细胞类型。
c. 分子生物学检测:通过PCR等技术检测细胞内特定基因的表达情况。
三、实验结果1. 原代培养结果(1)乳腺上皮细胞培养:在适宜的培养条件下,乳腺上皮细胞生长迅速,呈多边形或圆形,具有典型的上皮细胞形态特点。
(2)成纤维细胞培养:成纤维细胞生长较慢,呈梭形或星形,具有典型的成纤维细胞形态特点。
2. 细胞鉴定结果(1)形态学观察:通过显微镜观察,发现培养的细胞具有典型的乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态特点。
(2)免疫组化染色:通过特异性抗体染色,进一步证实了培养的细胞为乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
(3)分子生物学检测:通过PCR等技术检测,发现培养的细胞表达与乳腺上皮细胞和成纤维细胞相关的特定基因。
四、讨论通过对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定,我们成功获得了这两种细胞,并对其进行了形态学、免疫组化和分子生物学等方面的鉴定。
这为进一步研究这两种细胞的生物学特性和功能奠定了基础。
同时,原代培养技术的运用也为我们提供了更为接近自然状态下细胞的模型,有助于我们更好地理解奶牛的生理过程和疾病发生机制。
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奶牛乳腺上皮细胞原代培养
青岛农业大学产科实验室
杨文浩
实验材料:
PBS,青链霉素,酒精棉,手术刀,组织镊,75%酒精,广口瓶,离心机,移液器及Tip头,胶原酶Ⅱ,DMEM/F12培养基,血清,细胞计数板,细胞培养皿,显微镜。
口罩,工作服,手套。
准备:准备实验材料,工作台内消毒。
操作:
1.酒精棉擦拭奶牛乳腺,手术刀横向切开乳腺2/3处,切取富含颗
粒状腺泡的组织,置于含10%双抗的PBS中浸泡,清洗几次,将组织浸于75%酒精中消毒5min,再用PBS清洗,置于含双抗的PBS 中4°C迅速运回实验室。
2.将带回实验室的组织用PBS清洗,直至液体清亮。
3.将清洗干净的组织于大平板中进行剪取,避免结缔组织和血管,
用小手术剪刀一点点剪取颗粒状腺泡组织,浸泡于含双抗的PBS 中,继续清洗直至清亮。
4.弃去PBS,开始剪切组织,直至组织呈糜状,尽量剪的很细很小。
于15ml离心管中加入PBS1500rpm/5min。
清洗组织,至上清清亮。
5.弃去上清,加入2倍于组织体积的0.2%Ⅱ型胶原酶,37°C振荡
消化1.5小时左右,具体时间视消化情况而定。
一般消化至组织边缘模糊,液体呈稠状时即可。
6.加入PBS,2000/10min,弃上清,加入两倍组织体积的0.25%胰酶
振荡消化15-30min。
7.加入同等体积含20%FBS,10%双抗的DMEM/F12培养基终止消化,
过200目筛,滤液3000rpm/ 3min离心得细胞沉淀。
弃上清加入培养基重悬,调整细胞浓度,37℃,5%CO2培养箱培养。
8.2天内尽量不要移动细胞,第三天第一次换液,以后每隔一天或两
天换液一次,视细胞生长状况而定。
9.继续培养待细胞生长至80-90%时进行1-2或3传代。
10.新传代的细胞为第一代,最初培养的为原代。