BCA蛋白浓度测定-酶标仪法

BCA法测定蛋白浓度-酶标仪

一、药品

1.BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：

a)BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存

b)BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存

c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存

二、仪器和试剂

1.酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅

2.96孔单条可拆酶标板（平底）

3.15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用）

4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）

5.单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头

6.PBS

三、操作步骤

1.水浴锅调至37℃。

2.蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取

出，完全溶解并混匀。取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240μl PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。

3.计算BCA工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。

BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

4.按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。

蛋白标准品工作液（1 mg/ml）(l)PBS (l)

5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。

（1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低，

可适当调整稀释比例）

（2）再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。

123456789101112

A S0S0N1N1

B S1S1N2N2

C S2S2N3N3

D S3S3N4N4

E S4S4N5N5

F S5S5N6N6

G S6S6N7N7

H S7S7N8N8

6.用排枪在各孔中加入200μl BCA工作液，轻轻摇匀，37℃放置30分钟或室温放置2小

时。（注意：①每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。②如果浓度较低，可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）

7.用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。

8.用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算

公式Y=A X + B。根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。

9.按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml，分装为每支100μl。