结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测
探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变
探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变张婷;付军;王国治;陈保文;杨蕾;卢锦标;许晔;李庆阁【摘要】目的评价结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变检测试剂盒MehProTB/SL的分析性能以及临床性能.方法首先使用企业参考品对试剂盒的突变检出能力进行考察,之后将野生型基因组DNA以10倍梯度稀释后考察试剂盒的最低检测限,使用野生型质粒以及含常见耐药突变的质粒以不同突变比例混合考察试剂盒检测不均一耐药样本的能力,并使用23株非结核分枝杆菌标准株考察试剂盒的分析特异性,最后使用241份临床分离株对试剂盒进行临床评价.结果该试剂盒可以将9种耐药相关突变与1种野生型多态性与野生型进行区分.可以检测到低至5个拷贝的野生型基因组DNA.当突变比例为30％或更高时,试剂盒可以将其与野生型进行区分.23种非结核分枝杆菌的结果显示该试剂盒有良好的特异性.和比例法药敏试验进行对比,该试剂盒的临床灵敏度为卡那霉素90.0％(9/10),阿米卡星80.0％(8/10),卷曲霉素85.7％(6/7);特异性为卡那霉素98.8％(85/86),阿米卡星98.8％(85/86),卷曲霉素96.6％(86/89).试剂盒检测结果与测序结果一致.结论该试剂盒灵敏度高、特异性好,可以快速、准确地检测结核分枝杆菌注射类二线药常见的耐药突变,有望应用于临床.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】6页(P412-417)【关键词】结核分枝杆菌;注射类二线药;耐药突变;探针熔解曲线法【作者】张婷;付军;王国治;陈保文;杨蕾;卢锦标;许晔;李庆阁【作者单位】厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105【正文语种】中文【中图分类】R378我国结核分枝杆菌的耐药情况严重，耐药率高，给结核病的预防和治疗带来严峻挑战。
结核分枝杆菌多重耐药基因快速检测方法学的探究
论文作者签名：』边日期：逻！：！：！
保护知识产权声嚼
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Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ
Hale Waihona Puke 耐药基因 直接测序法溴化乙锭
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ
大肠杆菌
Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｌ－Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｚ－－胺四乙酸 异源双链形成法 初始耐药
独罐。睦毒嗡
秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本八声明所呈交的论文是藐 个八在导师指导下进行的砩究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他＾已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
聚丙爝溅胺
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ聚丙烯酰胺凝胶电泳
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｐｏｌ，ａｎｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
磷酸盐缓冲液 多聚酶链反应
两小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药
两小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药发表时间：2014-04-14T16:35:53.530Z 来源：《中外健康文摘》2013年37期供稿作者：赵立春[导读] .主要试剂与仪器：Gene Xpert IV 设备由多达4个模块组成，每个模块处理一个样品。
Gene xpert检测盒。
赵立春 (哈尔滨市香坊区结核病防治所 150000)【摘要】目的：研究同时检测患者是否结核，以及是否对利福平耐药，对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性，两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单。
【关键词】结核利福平耐药 Gene xpert检测试剂盒【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）37-0273-01 【结果】两个小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药，经过为时18个月的严格评估，2010年12月8日世卫组织认可Xpert MTB/RIF 作为一种全新的结核病快速检测新方法，世卫组织遏制结核病司司长Maoio Rarig lione博士评价Xpert MTB/RIF检测方法是全球结核病诊断和治疗方法的一个重要里程碑，为患结核病和耐药结核病危险的数百万人带来了新希望。
【Gene xpert】是世界上唯一的全自动一体化实时定量PCR检测系统；通过采用实时聚合酶链式反应，全自动医用PCR分析系统能自动完成并整合以下过程；核酸提取，扩增以及目标序列，在单或者复杂样品中的检测，采用一次性特定分析用Gene xpert检测盒制备和处理样本，将样本和所需试剂加入到检测盒中，然后将试剂盒放到一个可用的设备模块之中。
材料与方法：1.样本来源：哈尔滨香坊区结核病防治所2013年1月—2013年12月门诊患者。
2.主要试剂与仪器：Gene Xpert IV 设备由多达4个模块组成，每个模块处理一个样品。
Gene xpert检测盒。
方法：样品的准备及核酸的提取被提取核酸的扩增目标序列的检测Cartridge应盒，Cepheid获准专利的完备独立的反应盒，Gene xpert模块是一个独立可控温的荧光计，可对进行中的PCR反应进行实时监测，该模块可快速精准地控制反应样品温度保障反应的快速精准进行；每一个模块都具有四个光谱，这使模块可检测一个反应管中的多种荧光染料；每一个反应单元都相互独立。
等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因
等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【摘要】目的建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR (AS-PCR)检测体系,以间接判断对利福平(RFP)与异烟肼(INH)的耐药性.方法用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对.结果 AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1％ (39/41),其中rpoB 基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株；未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变；RFP敏感株均未检测到突变.AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5％(45/52),其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变；INH敏感株均未检测到突变.结论等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)004【总页数】4页(P249-252)【关键词】结核分枝杆菌;rpoB基因;katG基因;inhA基因;等位基因特异性扩增【作者】彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【作者单位】中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1;Q503传统药敏试验(绝对浓度法和比例法)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐药性检测的金标准，方法成熟可靠，但繁琐、耗时，难以满足临床对耐药结核病诊治的需求。
结核分枝杆菌实验室检测方法
结核分枝杆菌群
• 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包 括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲 分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌 （M.microti），前三种对人类治病，其中人型结 核分枝杆菌感染发病率最高。
6
生物学形状
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的 作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状， 大小为1～4X0.4μm。
细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有 大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般 用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色； 荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色
培养特性
培养基
• 营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃薯，
甘油及无机盐类的特殊培养基上生长，常用的 有罗氏固体培养基
• 专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最适温 培养条 度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8
件
• 菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳
菌落特 点
白色或淡黄色，菜花样
8
实验室检测方法
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
耐多药结核病做出快速诊断。
➢ 通 量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速 度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
24
五种结核检测方法效果评价
涂片法
MGIT 960 快速培养
斑点层析法
结核组：1260例
非结核组：100例
分子生物学检测方法
结核分枝杆菌的耐药性检测方式
结核分枝杆菌的耐药性检测方式【摘要】在应用抗结核药物医治结核病时，最为临床医师所关注的是细菌产生的耐药性。
因为结核分枝杆菌对医治药物不可幸免的产生耐药性，而阻碍肺结核病的医治成效。
以致成难治型肺结核。
【关键词】抗结核药物耐药性检测为使抗结核药物对肺结核病的医治取得预期成效，在应用药物医治之先，需要了解几个问题：一、试管内的抑菌浓度把抗结核药物加入培育基内，接种细菌以观看药物在多少浓度下能够抑制细菌生长，求出最小的抑菌药物浓度(MIC)，MIC是临床确信医治药物剂量的依据。
有关抗结核药物的MIC，请见短程化疗的细菌学基础。
应用不同培育基所测得的抑菌浓度有不同。
如在改良罗氏培育基测得的抑菌浓度比液体培育基或半流体培育基测得的抑菌浓度偏高。
细菌在发育生长旺盛期对药物灵敏，当细菌处于发育生长静止状态以致处于休眠期那么药物不呈现抑菌成效。
依据细菌发育生长的兴衰时期，组成肺结核病医治的基础。
二、血液内的药物浓度血液内抗结核药物浓度测定是研究药物在机体内的吸收与排泄，疗效与毒性的关系，体液内药物含量、散布、对细菌的有效抑菌浓度等。
可确信药物有效医治剂量与用药次数等。
由于结核病类型和发病部位不同，病变性质不同，有的药物吸收比较快、有的药物吸收比较慢。
有的体液内含药物浓度比较高，有的体液内含药物浓度比较低。
即便在相同的药物医治条件下，各器官、组织内的含药物浓度不尽相同，其间的不同是比较大的。
因此，血液内药物浓度的测定，在抗结核药物医治前和医治中均应进行药物浓度测定，以了解个体的药物代谢规律。
对某些病例而言，能够起到抗结核药物医治成效的监控作用。
一样规律。
肌内注射法给药吸收比较快、口服法给药吸收比较慢。
肌内注射法后30～60min，口服法后1～2h，血液内药物浓度即显现顶峰曲线。
内科研究室用生物学方式，观看链霉素肌注后，药物在体内的吸收，排泄的规律性，提供的技术资料为肺结核病的医治确信誉药剂量和给药次数等以供参考。
快速方法检测耐利福平结核分枝杆菌基因突变的研究
５ ０株 结 核 分 枝 杆 菌 均来 自 ２ ０ ０５
ｏ ｍｉ，４℃ ３ ，０ ｏ ０Ｓ７ Ｃ ３ ， ４ Ｃ４ ｎ９ ０ｓ６ ３ ，２ｏ ０ｓ共 ０个 Ｃ
利 福平 （ Ｆ ） 临 床 主要 抗 结核 药物 之 一 ， ＲＰ 是 结
核分枝 杆 菌对 Ｒ Ｐ耐 药 是结 核化 疗 失 败 的 主 要 原 Ｆ 因之一 。 当结 核 菌 株 对 Ｒ Ｐ产 生 耐 药 时 较 易 出现 Ｆ
备： 菌株培 养物 经 ０ ９ 氯 化 钠 注 射 液 ３次 离 心 洗 ．％
溶于 Ｔ Ｅ缓 冲 液 （ 羟 甲基 氨 基 甲烷 盐 酸 和 乙二胺 三
杆菌对 Ｒ Ｐ耐药与其 Ｄ Ａ依 赖性 Ｒ Ａ聚合 酶 Ｂ Ｆ Ｎ Ｎ 亚单位编码基因（ｐＢ 突变有关 Ｊ ｒ ） ｏ 。传统 的检测 药物 敏感 性 的方 法需 要 ２—３个月 时 间 ， 不利 于疾 病
的及 时诊 治 。随 着 分 子 生 物 学 的发 展 ， Ｎ Ｄ Ａ测 序 、
多 ； Ｎ Ｄ Ａ芯 片技术 虽然 可 以一 次 对 大量 位 点进 行
特异性 探 针 （ 见表 １ 。引物及 探 针 由上海 生工有 限 ）
公 司合 成 。③实 时 Ｐ Ｒ检 测 ： 引物 与探 针 用双 蒸 Ｃ 将 水 溶解 ， 终 浓 度 为 １ ｍｏ Ｌ 使 ０Ｉ ｌ 。按 照 每 个 反 应 管 ｘ ／ 检 测 １个标本 １ 突变 位点 来 配 制 Ｐ Ｒ反应 液 ， 个 Ｃ 即 每 个反 应管 里都 有 １ 结核 杆菌 特异 性探 针和 １条 条
１ 材 料 和方 法
结核杆菌及其耐药性快速检测
结核杆菌及其耐药性快速检测一、结核杆菌及其检测方法介绍结核分枝杆菌，又被称作结核杆菌，它是引发结核病的病原细菌。
主要通过呼吸系统结核患者传播，能够侵犯全身各个器官，最常见的为肺结核。
根据世界卫生组织的估算，全球每年增加的结核病人大约在800万左右，死于结核病的人大约在300万左右，全世界人口的三分之一，也就是大约17亿人曾经感染过结核杆菌。
在发展中国家，目前结核病的发病概率依然在持续地上升，在发达国家的病人也是有所上升的，比较常见于高危人群中（比如慢性酒精中毒的人、感染过HIV的病人、滥用药物的人以及无家可归的人）。
在控制结核的过程中，建立敏感、快速、特异的检测结核杆菌的手段具有非常重大的现实意义。
直到目前为止，结核的诊断依然主要依靠透视检查、临床症状、痰标本镜下检查、结核菌素试验或者痰标本结核杆菌培养等。
通过临床症状以及透视检查不能够发现早期的结核病人，并且特异性不是很强；结核菌素试验的特异性不是很强，阳性也只能说明在以前有否暴露在分枝杆菌下；痰标本镜检的敏感性和特异性也不能达到要求；培养的方法来分离结核杆菌是判断结核的重要标准，但是常规的培养方法需要的时间比较长，一般需要几个周的时间。
近年来，结核杆菌（包括牛型、人型、非洲型）在快速检测方面取得了快速的发展，主要包括基因扩增技术和改良液体培养方法。
建立准确、快速的耐药性检测方法，能够有效指导并制定科学合理的治疗方式，及时判断治疗是否成功，并且是否产生了耐药性，也有利于展开大规模的结核杆菌的耐药性调查。
之前基于培养方法来检测结核杆菌的耐药性，耗时比较长，并且结果不一定准确，这些年来，耐药性的快速检测方法已经取得了较大的进展，大体包括：噬菌体检测方法、改良液体培养方法以及基因检测方法等。
二、结核杆菌的快速检测方法（一）改良液体培养方法这些年来，已经建立了多种多样的改良液体培养方法，大大缩短了培养所需要的时间，这类的试剂盒包括了Bactec 9000MB、Bactec 460TB以及MGIT等。
探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变
了解感染 控制情 况 。引流 管通 畅的标 准是 引流 管 中可见 连续移 动 的 引 流液 或水泡 ，并且 敷料 一直处 于塌 陷状 况 。对 于新 鲜创 面坏 死组 织 较多和 并发 感染 的创面 ，虽 不主 张局部 用药 ，但在 引 流器件 冲洗 引 流管 管腔 时用 少量 敏感 抗生 素有 时会 达到 事半 功倍 的效 果 。该 】
ｒ ｃｕｒ ｔ ｍａ ｓｖ ｏｎ ｎｄ ｓｆ ｔ ｓ ｅｅ ｔａ ｕ ｅｉ ｅ ｔｏ ｆａ ｔ ｅｗｉ ｓｉｅｂ ｅａ ｏ ｓｕｅｄ ｆ ｃ ｄ ｓ ｐ ｒｎｆｃｉｎ ｈ ｔｉ ｎ
较多有的甚至形成耐药，增加了临床治疗难度。在抗生索冲洗液持
续 灌洗 的情况 下 ，抗 生素 可直达 创面 即可通 畅 引流又 可持续 杀菌 ，
【 摘要 】 目的 对 采用探针 熔解 分析 法对 结核 分枝 杆 菌的链 霉素 耐药 突 变情况进 行快速 检 测的应 用价 值进行 研 究分析 。方法 抽取 ７ ０ 结核 ４株
分枝杆 菌 的临床 分 离菌株 ，采 用探 针熔 解 分析 法 ，对链 霉 素耐 药 突 变情 况进行 检 测 。结果 ７０ 结核 分枝杆 菌 中有 ８ 株 发 生 突 变，９ ４株 ６ 份 标 本 中发现 杂合 信号 ，８ 标 本 中没有任 何 信号 。２ 份 存 在药敏 性 的标 本 的检 测 结果 均显 示 为野 生型 ，有耐 药性 的 １ 份 标 本 中仅 有 ５ 份 ９ ３ 份 存 在 突 变现 象 ，另 外的 ８ 份标 本检 测 结果 显示 为野生 型。结 论 采用探针 熔 解分析 法对 结核 分枝杆 菌的链 霉素耐 药 突 变情况进 行 快速检 测 ， 其特 异性 非 常明显 ，且具 有快 速、 准确 的特点 。 【 关键 词】 探针 熔 解分析 法 ；结核 分枝杆 菌 ；链 霉素 ；耐 药 突 变
几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法
肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。
菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。
大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。
目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。
近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。
筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。
目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。
结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。
实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。
近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。
目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。
主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。
传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。
离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。
作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。
但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。
有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。
我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。
因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。
再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。
我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。
1 资料与方法1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。
107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。
65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。
1.2 引物序列为1.3 方法1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。
紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。
然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。
本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。
一、耐药性机制1.多重耐药（MDR）多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。
这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。
2.延迟耐药（XDR）延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。
这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。
3.全耐药（TDR）全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。
然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。
二、检测方法1.传统的抗生素敏感性测试传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。
通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。
尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。
2.分子检测方法随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。
这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。
由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。
3.流式细胞术流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。
通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。
这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。
4.质谱法质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。
结核分枝杆菌(MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用
结核分枝杆菌 (MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用摘要：目的：研究在结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测在结核患者中的检测效果。
方法：选取2019年4月～2020年4月在我院治疗的肺结核患者562例，分别进行Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测、液体培养法、直接涂片三种检测方法，将临床诊断作为金标准。
结果：MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测的准确度、灵敏度、特异度均高于液体培养法与直接涂片法，P＜0.05。
结论：在结核病的检测中，采用MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测具有较高的诊断价值。
关键词：结核分枝杆菌；耐药突变基因；结核病结核病是常见的感染病，是由结核分枝杆菌（MTB）引起的强烈的慢性疾病，最常见的为肺结核，是导致人类死亡的主要原因之一。
据有关统计学报道，我国每年新发的结核患者可多达上百万里，仅次于印度及印度尼西亚。
我国对结核病的防治规划是在2030年之前，争取将结核病的发病率降低80％，为了实现这个目标，对结核病患者的早期诊疗及耐药性检测就非常重要了[1]。
当前结核病的诊断依然依赖传统的涂片及培养法，培养周期长，生物安全性高，检出率较低。
近些年开始推荐Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测，具有快速便捷的作用[2]。
本文就Xpert MTB/RIF系统结合利福平对可疑肺结核患者进行检测，评价此检测方式在耐药突变基因中的检测价值进行研究，现汇报如下。
1.资料及方法1.1一般资料选取我院收治的562例疑似肺结核患者，均于2019年4月～2020年4月期间收治，男369例，女193例，年龄：18-75岁，平均年龄（42.45±9.81）岁。
临床诊断结果显示562例疑似结合患者中，MTB阳性424例、阴性138例。
1.2方法所有患者均采用美国BD公司生产的BACTECMGIT960系统、MGIT管及利福平药粉；采用美国Cepheid公司生产的Xpert MTB/RIF设备及试剂盒以及贝索公司生产的抗酸染液。
PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因
PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因发表时间：2017-12-18T16:06:19.960Z 来源：《心理医生》2017年33期作者：张霞[导读] 结核病是危害人类生命健康的传染病，给患者带来了严重的身心伤害，尤其是耐药结核病。
（太原市第四人民医院山西太原 030053）【摘要】目的：探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。
方法：对2015年8月到2016年8月期间，在我院收治的96例肺结核患者进行研究。
采用PCR-SSCP法，对50株MTL型临床分离株进行测试。
同时，进行常规的药敏实验。
然后，对比检测的结果。
结果：在96例肺结核标本中，有54份被检出为MTL型，占56.3%，包括42例人型结核分支杆菌，12例牛型结核分支杆菌。
在药敏试验中，将50株MTL型临床分离株作为研究对象。
其中，有24株敏感，耐药率为52%。
通过PCR-SSCP分析中，显示21例为阳性，检出率为42%。
在恢复试验中，显示21株rpsL基因突变株中，15株依然对利福平有耐药性，占到71.4%。
29株rpsL基因阴性株中，有26株恢复为细菌性，占到89.7%。
结论：对50株MTL型临床分离株进行测试后，有24株对利福平产生耐药性，占52%。
21株显示阳性，检出率为42%。
根据药敏结果，以及PCR-SSCP法，得出的两种办法的符合率为80.9%。
【关键词】结核分支杆菌L型；rpsL；耐药基因；PCR-SSCP；检测；分析【中图分类号】R450 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）33-0180-02结核病是危害人类生命健康的传染病，给患者带来了严重的身心伤害，尤其是耐药结核病。
利福平作为杀菌药物，成为抗结核化疗方案之一。
然而，受到耐药株、结核分支杆菌的影响，降低了治疗效果，结核病的治疗带来了很大障碍[1]。
因此，医生必须引起重视，并采取有效的措施，以此来提高治疗效果。
本文的目的在于探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。
基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药性
ｆ ｔｅｔ ｇｔ Ｉ ｎａｉ ＩＨ）ａｄＲｆ ｉ ｎ（ Ｆ ａ ｓｎ ｏｉｚ ｓｔ ｉ ｏｓ ｄ（Ｎ ｎ ｉｍｐｃ Ｒ Ｐ）ｉ ｃｂｃｅ ｕ ｂｒｕｏｉ ＭＴ ．Ｍｅｈ ｄ Ｔ ｅｄｔ ｆＮ ｄＲ Ｐｒ— ａ ｉ ｎＭｙｏ ａｔｉｍ ｔ ｅｃ ｓ ｒ ｕ ｌ ｓ（ Ｂ） ｔｏ ｓ ｈ ａ ｏ Ｈ ａ Ｆ ａ Ｉ ｎ ｅ
Ｒｅｕ ｔ Ｔｈ ｅｕｔ ｆ ｅ ｓｔ ｉ ，ｓ ｃｆｃｔ ，ｐ ｓｔｖ ｒｄｃｉｅｖ ｕ ，ｎ ｇ ｔ ｅｐ ｅ ｉｔｖ ａｕ ，ａ ｄａ ｃ ｒｃ ｂｍｎ ｄｕ ｉｇｔｅｇ ｎ ｓ ｌｓ ｅｒｓ ｌ ｏ ｎ ｉｖｔ ｐｅｉ ｉ ｓ ｓ ｉ ｙ ｉｙ ｏｉ ｅｐ ｅ ｉｔ ａ ｅ ｅ ａｉ ｒｄｃｉｅｖ ｅ ｎ ｃｕ ａ ｙｏ ｔ ｅ ｓｎ ｅ ｅ ｉ ｖ ｌ ｖ ｌ ｈ
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结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测
结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测吴雪琼 庄玉辉 何秀云 李国利 张晓刚 摘要 目的 了解结核分支杆菌链霉素(Sm)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。
方法 通过聚合酶链反应2单链构象多态性(PCR2SSCP)分析了22株结核分支杆菌临床分离株的rp s L基因,并应用PCR2限制性片段长度多态性(PCR2R FL P)进一步分析其突变的部位和性质。
结果 以H37R v标准株为对照,5株敏感株的rp s L基因未见SSCP泳动异常、有M bo 酶切位点;13株耐Sm株中,11株(86%)有rp s L基因泳动异常、无M bo 酶切位点;4株耐其它抗结核药物株中,也有1株SSCP泳动异常、并无M bo 酶切位点。
结论 大多数结核分支杆菌Sm耐药分离株有rp s L突变,而突变位点大多位于第43位密码子。
应用PCR2SSCP和PCR2R FL P可能成为快速检测结核分支杆菌耐药突变株的新方法。
关键词 分支杆菌,结核 聚合酶链反应 多态现象,单链构象 多态性,限制性片段长度 药物耐受性D etection of M.tuberculosis strepto myc i n-resistan t gene W u X ueqiong,Z huang Y uhu i,H e X iuy un, et al.T he T ubercu losis R esearch L aboratory,the309th H osp ital,P l A,B eij ing100091 Abstract Objective To observe the m utati ons of rp s L gene in M.tuberculo sis strep tom ycin2re sis2 tant iso lates,and to develop a ne w m ethod fo r detecting drug resistance.M ethod D etecting the rp s L as a contro l.In22M.tuberculo sis clinical iso lates,the rp s L PCR2RFL P.Results Strain H37Rv w as used as a contro l.In22M.tuberculo sis clinical iso lates,the rp s L PCR fragm ents from5drug2suscep2 tible iso lates had no differences in the SSCP p rofiles w ith strain H37Rv,and w ere restricted by M bo . 11of the13strep tom ycin2resistant iso lates show ed apparent differences in the SSCP p rofiles and w ere no t digested w ith M bo .1of the4o ther drug2resistant iso lates also had apparent SSCP differences and w as no t digested by M bo .Conclusion s The results suggested that the rp s L gene m utati on w as frequantly observed in M.tuberculo sis strep tom ycin2resistant iso lates,and usually situated at codon 43,PCR2SS2CP and PCR2RFL P m igh t becom e a si m p le,rap id and reliable diagno stic test fo r drug re2 sistance.Key words M ycobacterium tuberculo sis Po ly m erase Chain Reacti on Po ly mo rph is m,single2 stranded confo r m ati onal Po ly mo rph is m,restricti on fragm ent length D rug to lerance 由于多耐药菌株的传播和有限的抗结核药物,结核分支杆菌的耐药问题十分严重,1992年美国发生了几起多耐药结核病的爆发流行[1]。
亚能结核分枝杆菌耐药突变(gcmtb)检测项目开展指南
亚能结核分枝杆菌耐药突变（GC－MTB）检测项目开展指南一结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测实验流程示意图二实验室建设1最佳结核分枝杆菌耐药突变基因检测实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及杂交分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。
3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。
4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套。
出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。
5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括微量移液器、离心机、水浴锅、试管架、一次性手套、移液枪头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。
2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。
4）每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌。
3 实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。
2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。
3）操作人员需要有强烈的责任感，工作认真细心。
4）操作人员需要严格遵守MTB耐药突变基因检测工作的标准操作规程。
三实验所需试剂、设备及其功能简介整个结核分枝杆菌（MMTB）耐药突变基因检测实验由以下三个实验组成：临床痰样的处理（DNA的提取），基因扩增（PCR）和杂交分析。
1 实验所需试剂2 实验所需仪器（推荐使用）及功能简介结核分枝杆菌耐药突变基因（GC-MTB）临床检测结果及常见问题解答1MTB耐药检测方法有哪些？1）MTB耐药检测目前常规的方法是药敏培养法，但该法操作复杂，耗时长（需3至4周），且培养困难，容易产生假阴性，以致造成误判和延误病人的最佳治疗时间。
2）MTB基因水平的检测○1 DNA测序法：对耐药基因的PCR产物进行直接测序，然后与标准敏感株的DNA片段比较，分析碱基突变的位置和分布。
结核分枝杆菌的耐药性检测方法
结核分枝杆菌的耐药性检测方法简介：结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内广泛存在。
然而，随着抗生素的滥用和不当使用，耐药性分枝杆菌株的出现成为一个严峻的问题。
因此，准确、快速地检测耐药性对于结核病防控至关重要。
本文将介绍几种常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
传统涂布法：传统涂布法是一种经典而常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法需要将分离得到的结核杆菌培养在含有不同抗生素的琼脂平板上，并进行48小时以上培养。
通过观察菌落生长情况和对比试验，可以确定其耐药类型。
然而，这种方法操作复杂、时间较长且结果受到人为判断主观因素影响，已逐渐被新型技术所取代。
PCR扩增法：聚合酶链反应（PCR）扩增法是一种高效、敏感且特异性强的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它基于DNA的扩增原理，通过引物特异性靶向结核分枝杆菌核酸片段进行扩增，并通过特定技术判断结核杆菌是否存在耐药基因。
PCR可以在短时间内得到结果，并且可以同时检测多个抗生素的耐药性。
然而，PCR方法需要专业实验室设备和一定的操作技巧，不适合于基层医疗机构。
快速涂片法：快速涂片法是一种经济简便、结果迅速的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法利用亲水性阳离子染料对细胞壁进行着色，分析红细胞上色素的扩散情况，从而确定是否存在抗药型结核分枝杆菌。
这种方法操作简单、成本低廉且结果直观可靠。
然而，在高密度培养物中检出阳性样本可能会受到其他非结核分枝杆菌污染的影响。
气质联用仪法：气质联用仪法是一种新兴的结核分枝杆菌耐药性检测技术。
该方法基于结核杆菌产生的气体代谢产物，通过检测气相色谱和质谱的联用技术来分析结核分枝杆菌对抗生素的耐药性。
这种方法具有高效、快速、无需培养的优势，并且可以同时检测多种抗生素。
然而，由于设备昂贵且操作复杂，需要专业实验室支持。
基因测序法：基因测序法是一种准确度极高的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它通过对整个细菌基因组进行全序列测定，包括靶区的引物设计、DNA提取、文库构建以及高通量测序技术等步骤，可以获得详尽的耐药性信息。
快速方法检测结核分枝杆菌耐药基因突变
快速方法检测结核分枝杆菌耐药基因突变
钱春莲;余海根;戴女好
【期刊名称】《中国微生态学杂志》
【年(卷),期】2008(20)4
【摘要】快速准确地鉴定结核分枝杆菌与结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测,对结核病人的诊断与治疗具有重要指导意义。
本次根据结核分枝杆菌标准株H37RV序列,利用覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针,并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况,以此来判断耐药结果,并对其进行方法学评价。
【总页数】2页(P405-406)
【关键词】结核分枝杆菌;结核;抗多种药物性;利福平;异烟肼
【作者】钱春莲;余海根;戴女好
【作者单位】深圳市人民医院检验医学部
【正文语种】中文
【中图分类】R446.9
【相关文献】
1.针对gyrA基因突变的反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的研究 [J], 郭倩;李桂莲;魏剑浩;赵丽丽;赵秀芹;吴移谋;万康林
2.结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法的建立 [J], 李芳芳;方红辉;何林;吴伟元;廖生;张舒林
3.分析DNA微阵列芯片法快速检测结核分枝杆菌(MTB)KatG、inhA和rpoB基因突变及其与异烟肼(INH)、利福平(RFP)耐药的关系 [J], 窦敏; 范天利
4.2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究 [J], 薛建昌;梁冰锋;吴海峰;郑浩;孙志平;任哲
5.2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究 [J], 薛建昌;梁冰锋;吴海峰;郑浩;孙志平;任哲
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结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测
近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。
作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。
但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。
有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。
我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。
因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。
再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。
我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。
107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。
65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。
1.2 引物序列为
1.3 方法
1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。
紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。
1.3.3 SSCP银染PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10 min，立即冰浴5 min，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃/100V电压，电泳约2~3 h，电泳结束后，取凝胶板经硝酸银染色，观察结果并照相。
2 结果
2.1 61株结核分支杆菌临床分离株中，26株药物敏感株中，各有1株KatG 基因和rpoB基因发生突变。
35株同时耐异烟肼和利福平分离株中，有22株有KatG基因突变，突变率62.9％。
同时有31株有rpoB基因发生突变，突变率为88.6％。
结果见表1。
2.2 用PCR-SSCP技术分析对39例同时耐INH和耐RFP肺结核病患者的痰标本和24例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。
以结核分支杆菌H37RV为对照，39例耐RFP痰标本中31例PCR扩增阳性，其中25例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，rpoB突变率为64.1％。
耐INH肺结核病患者的痰标本有28例扩增阳性，17例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为4
3.5％。
24例非结核病患者的痰标本rpoB基因和KatG基因PCR扩增
均为阴性。
3 讨论
目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。
但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需6~8周甚至更长，不能及时指导临床用药。
近年来，随着分子生物学的不断发展已研究发现结核分支杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关
PCR-SSCP是一种检测基因突变简便、快速的方法。
我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。
再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性，结核分支杆菌临床分离株rpoB基因和KatG基因突变，阳性率分别为88.6％、62.9％，表明结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关，KatG基因在INH耐药中起主导作用。
但有一部分耐INH株未检测到KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐INH形成可能与KatG 无关。
INH耐药机制有待进一步研究。
同时表明结核分支杆菌耐利福平与RNA 聚合酶的p亚基的编码基因rPOB有关，rPOB突变已成为结核分支杆菌耐RFP 的主要遗传指标。
我们用此方法直接检测结核病患者痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，阳性率分别为64.1％、43.5％。
rpoB基因和KatG 基因突变低于临床分离株。
这可能与痰标本中杂DNA较多，rpoB为单拷贝，同时痰标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增也有直接影响。
本文的结果表明，PCR-SSCP方法具有快速、简便、敏感、特异性高的特点，可在2 d内出结果，并能直接用于临床结核病患者痰标本结核分支杆菌耐药性的检测。
从而弥补了常规药敏实验的不足，有望成为临床耐药性测定的重要手段之一。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。