结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测

结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。

1.2 引物序列为

1.3 方法

1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。

1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。

1.3.3 SSCP银染PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10 min，立即冰浴5 min，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃/100V电压，电泳约2~3 h，电泳结束后，取凝胶板经硝酸银染色，观察结果并照相。

2 结果

2.1 61株结核分支杆菌临床分离株中，26株药物敏感株中，各有1株KatG 基因和rpoB基因发生突变。35株同时耐异烟肼和利福平分离株中，有22株有KatG基因突变，突变率62.9％。同时有31株有rpoB基因发生突变，突变率为88.6％。结果见表1。

2.2 用PCR-SSCP技术分析对39例同时耐INH和耐RFP肺结核病患者的痰标本和24例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。以结核分支杆菌H37RV为对照，39例耐RFP痰标本中31例PCR扩增阳性，其中25例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，rpoB突变率为64.1％。耐INH肺结核病患者的痰标本有28例扩增阳性，17例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为4

3.5％。24例非结核病患者的痰标本rpoB基因和KatG基因PCR扩增

均为阴性。

3 讨论

目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需6~8周甚至更长，不能及时指导临床用药。近年来，随着分子生物学的不断发展已研究发现结核分支杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关

PCR-SSCP是一种检测基因突变简便、快速的方法。我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性，结核分支杆菌临床分离株rpoB基因和KatG基因突变，阳性率分别为88.6％、62.9％，表明结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG有关，KatG基因在INH耐药中起主导作用。但有一部分耐INH株未检测到KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐INH形成可能与KatG 无关。INH耐药机制有待进一步研究。同时表明结核分支杆菌耐利福平与RNA 聚合酶的p亚基的编码基因rPOB有关，rPOB突变已成为结核分支杆菌耐RFP 的主要遗传指标。我们用此方法直接检测结核病患者痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，阳性率分别为64.1％、43.5％。rpoB基因和KatG 基因突变低于临床分离株。这可能与痰标本中杂DNA较多，rpoB为单拷贝，同时痰标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增也有直接影响。本文的结果表明，PCR-SSCP方法具有快速、简便、敏感、特异性高的特点，可在2 d内出结果，并能直接用于临床结核病患者痰标本结核分支杆菌耐药性的检测。从而弥补了常规药敏实验的不足，有望成为临床耐药性测定的重要手段之一。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文