转基因技术及其在棉花育种中的应用

转基因技术在棉花育种中的应用杨金惠 812031001 作物领域 2012级摘要：棉花是一种重要的经济作物，在我国广泛种植。

培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。

本文介绍了转基因棉花主要的研究方法，包括转化方法以及转入的基因等，并对转基因棉花的发展趋势作了相关探索。

此外，本文总结了转基因技术在棉花遗传改良中的应用，包括棉花抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆以及品质改良等方面的最新进展，并对棉花转基因研究中存在的主要问题和今后的研究与应用前景进行分析和展望。

关键词：转基因；棉花；育种1973 年美国科学家科恩等人第一次将两种不同的DNA 分子进行体外重组, 并且在大肠杆菌中表达以来, 基因工程技术发展飞速, 该技术正在极大地改变着地球生物固有的进化进程。

据不完全统计, 目前全球已有60 多种转基因园艺植物和大田作物相继问世, 其中转基因工程技术在棉花品种改良中的应用, 成效卓著。

自从1983年人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物重组DNA技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，培育成功一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。

棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的,CryA+CPTI双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。

美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。

1.转基因技术棉花转基因技术是指将外源DNA通过物理、化学或生物学方法导入棉花细胞并得到整合和表达的过程。

在棉花遗传转化体系中，主要有农杆菌介导、花粉管通道和基因枪3种转化方法。

本研究拟对. 种方法的主要技术特点及研究和应用动态进行综述，旨为棉花分子育种提供参考。

1.1．农杆菌介导法1.1.1农杆菌转化技术的理论基础与棉花遗传转化有关的根癌农杆菌是一种土壤习居菌，在自然状态下能感染棉花等大多数双子叶植物营养器官的伤口，导致冠瘿瘤的发生。

根癌农杆菌含有一种Ti质粒，侵染时通过棉花器官的伤口进入寄主组织，但其本身不进入寄主植物细胞，只把Ti质粒的T-DNA片断导入棉花的基因组中并得以表达，且外源DNA 表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。

由于Ti质粒本身能插入大到50kb的外源DNA，因此利用此转化载体，将Ti质粒上致瘤基因切除，代之以有益的外源DNA 序列，并插入由真核型启动子和细菌抗生素抗性选择标记基因或报告基因组成的嵌合基因，将改造后的农杆菌侵染棉花器官或细胞，在加有相应选择因子的培养基上选择转化再生植株，进而可得到转基因植株。

1.2.花粉管通道法1.2.1花粉管通道转化技术的理论基础从整体上说，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的。

但从进化的角度来看，任何生物DNA均由4种核苷酸组成，这样就可能在顺序上出现不同程度的相同排列，因此部分基因的结构有可能保持一定的亲合性。

虽然进化中同时存在着相当强的保守性，但生物的主要基础代谢，如糖、氨基酸、能量代谢、蛋白质和核酸的生物合成与分解等都是共有的（如有90% 以上的已知酶在各种生物中都是共有的）。

当外源花粉的基因组进入母体（受体）后，大部分片段被分解，侥幸保存下来的某些DNA 片段有可能整合进入受体的染色体，在子代中表达典型的或更多是非典型的遗传变异。

外源DNA片段进入受体，整合是随机的，可能整合到结构基因中，也可能通过调控基因或重复序列以调控方式发挥作用。

1.2.2花粉管通道法转化的棉花植株后代遗传特点性状变异广泛，类型丰富，稳定快，变异频率较高。

研究表明，由外源DNA 直接导入所引起的性状变异，涉及棉花的各类质量和数量性状，包括植株形态、生长发育、生理生化、抗性、产量构成等各个方面，一般变异性状在D3或D4代就能够稳定，大大缩短了育种进程。

同时，总DNA导入引起的变异在表型、生理生化产物及DNA分子标记的3个层次上与常规育种产生的变异极为相似。

通常转化率为1%-10%。

遗传较为复杂。

有些变异既不是供体性状也不是受体原有性状，后代的分离现象，有的符合孟德尔规律，但大多数是不符和的。

1.2.3在棉花上的研究现状及应用在应用方面，1981年黄骏麒等应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入到高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。

谢道昕等通过花粉管途径将苏云金芽孢杆菌杀虫基因（Bt 基因）导入棉花，获得了转基因抗虫棉，并首次获得转基因的分子证据。

之后，我国学者通过此方法陆续将Bt,Bt+CpTI,sGNA等基因导入中国主栽棉花品种中，目前已育成许多转基因品种(系）。

1.3基因枪法1.3.1 基因枪转化技术的理论基础基因枪法（Particle gun），又称微弹轰击法，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。

其基本原理是将外源DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压作用下将微粒高速射入受体组织或细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物基因组上，并得到表达，从而实现基因的转化。

因为微粒的体积非常小，且射击速度很快，所以外源基因进入细胞后仍能保持正常生物活性，被轰击过的细胞或组织，虽含有颗粒，但仍能存活，发育不受太大的影响。

1.3.2 研究进展和应用基因枪转化技术在棉花遗传转化中尚处于研究和起步阶段。

John等第一次将此技术应用于棉花遗传转化中，以胚性悬浮细胞系为受体进行轰击，成功得到转化植株；之后，McCabe等以茎尖分生组织为受体、郝秀英等以棉花下胚轴为受体、Rajasekaran等用胚性细胞悬浮系为受体均获得了抗性转化植株。

谢迎秋对叶肉细胞进行轰击研究棉花曲叶病毒反式作用因子Ac2的功能等。

到目前，使用基因枪进行棉花的遗传转化不过十几年的时间，还有许多问题需要进一步研究。

棉花基因枪转化效率一般为0.001%-0.01%，因此，如何提高转化率是有待解决的核心问题，国内外的研究主要围绕转化前受体材料类型、渗透处理、多茎尖诱导及劈开分生组织暴露出敏感层等，研究和提高外植体的接受能力及外植体的数量，同时研究轰击后细胞的恢复调整和梯度筛选强度等，以提高植株再生效率，优化转化技术体系，进而提高基因枪转化率。

1.4其他方法获得转基因棉花的方法还有很多，例如PEG介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等。

2. 转基因棉花育种成就2.1 抗虫基因工程目前应用于棉花的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌的内毒素蛋白(Bt基因)、从植物中分离的昆虫蛋白酶抑制剂(PI基因)和植物凝集素基因(1ectin)。

2.1.1转Bt抗虫棉美国Agracetus 公司1987 年首次报道已获得外源标记基因的珂字312 遗传工程棉花, 不久该公司利用农杆菌Ti 质粒介导法在世界上首次将苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因转入商品棉。

连续两年的室内和罩笼鉴定表明, 转基因棉花抗鳞翅目幼虫, 抗性特征稳定, 并可通过种子遗传。

但大田抗棉铃虫试验效果不理想, 主要原因是转基因棉花中毒蛋白含量不够1990 年Monsanto 公司将改造的Bt基因导入棉花, 参加大田试验的转基因材料中Bt基因表达产物的含量提高了100 倍。

1996年Monsanto 公司与岱字棉公司合作, 开展转Bt 基因抗虫棉的选育和品种的商业化工作, 并迅速将抗虫棉种子销售市场拓展到中国的河北、安徽、山东等省, 目前抗虫棉品种33B 占据中国抗虫性市场的半壁江山, 估计在黄河流域的推广面积已累计达13313 万hm2。

Monsanto 公司最近又育成具有2 个Bt 基因的棉花新品系—BGII。

田间试验表明新品系对棉铃虫, 尺、甜菜夜蛾都有很好的抗性。

另外, 澳大利亚、前苏联、法国也培育出抗虫棉品种。

国内棉花抗虫基因工程起步较晚, 但发展迅速。

中国农科院生物技术研究所、江苏省农科院经济所、山西省农科院棉花所、中国农科院棉花所等先后报道利用基因工程技术和常规育种手段相结合的方式, 获得了一系列转Bt 基因抗虫棉品系。

目前已通过审定的国产转Bt基因抗虫棉品种有: GK - 1、GK12、GK19、GK22、中38 、南抗3 号等。

2.1.2 转Bt + CPTI 双价抗虫棉目前国内外转基因抗虫棉普遍存在抗虫性的遗传稳定性问题。

转Bt基因单价抗虫棉只能产生一种杀虫蛋白, 主要对棉铃虫等鳞翅目害虫有抗性。

但有关研究表明, 转单一Bt杀虫基因抗虫棉种植若干年后, 棉铃虫有可能产生抗性。

Bt 抗虫棉抗虫谱较窄, 抗虫范围局限性较大, Bt 抗虫棉主要只对鳞翅目中的一些害虫具有抗性。

其次, Bt 抗虫棉的抗虫性表达具有时空性, 随着叶子的老化, 抗虫性下降。

目前转Bt 基因抗虫棉品种的遗传基础比较薄弱, 一旦抗性崩溃, 其后果将是惨重的。

与单价抗虫基因相比, 双价抗虫基因可成倍延长品种的抗性。

据2001 年信息, 由中国农科院生物技术研究所构建Bt + CPTI双价抗虫基因,利用花粉管通道法导入受体品种石远321 , 成功地培育出SGK321 双价基因抗虫棉, 并于1999 年6 月通过农业部生物基因安全性评价, 获准在4 个省份进行商品化生产SGK321 双价转基因抗虫棉同现有的单价抗虫棉相比, 最大的优点在于其具有更稳定持久的抗虫性。

2.1.3蛋白酶抑制剂基因的转化目前应用于棉花的PI基因主要是豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cp—Ti基因)和慈菇蛋白质酶抑制剂(API基因)。

分别将CpTi基因和修饰过的CpTi基凼导人棉花，获褥的转基因植株后代对抗棉铃虫具有明显的抗性。

API对多种蛋白酶具有抑制活性，其抗虫能力优于CpTi基因。

2.1.4 植物凝集素基因的转化棉蚜是棉花的另一个主要害虫，随着抗棉铃虫转基因棉花的普遍种植，棉蚜的危害逐渐加重。

因此，利用转基因技术获得抗蚜棉花品种已成为棉花抗虫育种的新课题。

植物凝集素是一类具有特异糖结合的活性蛋白，有些具有抗虫性，特别是对蚜虫等同翅目害虫有极强的抗杀作用。

将来源于小麦胚芽凝集素基因导人陆地棉后，转基因T。

代能显著抑制棉铃幼虫和棉蚜的生长发育；而将Bt+GNA双价基因导人棉花后，获得的转基因株系对棉铃虫和棉蚜有较好的抑制效果。

抗除草剂棉花棉田杂草种类繁多，给棉花生产造成严重干扰，而由于棉花不含抗除草剂基因。

所以把外源抗除草剂基因转人棉花，使棉株对某种除草剂具有抗性，对棉花生产意义重大。

棉花中成功应用的抗除草剂基因是：抗草甘膦(glyphosate)基因、抗溴苯腈(bromoxyril)基因和2，4一D单氧化酶基因(tfdA)。

2.2.1抗草甘膦基因的转化1989年，Deaton等将编码异构EPSP草甘膦合成酶基因(aroA)转入棉花，选育出抗草甘膦除草剂的转基因棉花。