组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学实验技术，用
于研究基因表达和调控机制。
该技术利用特异性抗体识别和结合染色
质上的特定蛋白质，然后通过免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段，从而确定该蛋白质在染色质上的结合位置和作用机制。
ChIP技术的基本步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤、反交联和DNA提取。
首先，通过交联剂如甲醛将细胞或组织中的染色质与蛋白质进行固定化。
然后将细胞或组织裂解并利用特定抗体选择性地捕获
目标蛋白质与其所结合的DNA片段。
接下来，通过洗涤去除非特异性结合并保留与目标蛋白质结合的DNA片段。
最后，通过反交联将DNA片段从蛋白质中释放出来，并进行PCR扩增或测序等分析。
ChIP技术可以用于研究许多生物学问题，如转录因子与DNA的结合、组蛋白修饰和染色质重塑等。
例如，可以通过ChIP技术确定某个转录因子在基因调控中的作用机制，或者确定某个组蛋白修饰对基因表达
的影响。
总之，染色质免疫沉淀技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以
帮助我们更好地理解基因表达和调控机制。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一种用于研究染色质蛋白相互作用的关键技术，它可以帮助我们理解基因组上的DNA结构与功能之间的关系。
本文将介绍染色质免疫沉淀技术的原理、步骤和应用。
染色质免疫沉淀技术的原理基于特定抗体与染色质上的目标蛋白结合的能力。
通过将染色质与细胞核蛋白一起交联，然后使用适当的酶切酶切割DNA，将与目标蛋白结合的DNA 片段与抗体结合，最后通过沉淀纯化和逆交联来获取与目标蛋白相互作用的DNA片段。
这些DNA片段可以通过PCR扩增或高通量测序来分析，从而确定目标蛋白与基因组上的特定DNA区域的相互作用。
1. 细胞处理：选择适当的细胞类型和处理条件，如细胞状态（正常、疾病或处理后）、细胞密度和处理时间等。
2. 细胞交联：给细胞添加交联剂（一般为福尔马林）来固定细胞核内蛋白与DNA的相互作用。
3. 核提取：裂解交联细胞，将细胞核提取出来。
核提取过程中添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解。
4. 酶切：使用适当的酶切酶切割DNA，产生与目标蛋白结合的DNA片段。
5. 免疫沉淀：将抗体与目标蛋白特异性识别的DNA结合起来。
可以使用预包被蛋白G 或蛋白A纯化好的抗体，并将其加入核提取物中。
这样就可以使抗体与特定蛋白结合，并形成免疫复合物。
6. 沉淀纯化：使用磁珠或其他材料将免疫复合物与其他非特异性结合物分离。
通过洗涤等步骤去除非特异性结合物。
7. DNA释放：对免疫复合物进行逆交联，从而释放出与蛋白相互作用的DNA。
8. DNA分析：通过PCR扩增或高通量测序等方法对所得到的DNA片段进行分析。
可以使用特定的引物或在全基因组范围内进行扩增。
染色质免疫沉淀技术已经广泛应用于生物医学研究中，特别是在基因调控和表观遗传学领域。
以下是染色质免疫沉淀技术的主要应用：1. 转录因子与基因调控：通过分析转录因子与染色质上的相互作用，可以研究转录因子对基因的调控机制。
可以确定转录因子的结合位点，并研究其对基因的表达水平和活性的影响。
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。
2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。
随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。
4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。
5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。
通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。
该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。
chip-seq过程
chip-seq过程Chip-seq（染色质免疫沉淀测序）是一种常用的基因组学技术，它可以用来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
本文将详细介绍chip-seq的过程及其应用。
一、引言Chip-seq是一种结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序（sequencing）的技术，用于研究特定蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该技术，我们可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并进一步了解这些结合位点在基因调控中的作用。
二、实验步骤1. 交联：首先，将细胞或组织交联，使DNA与蛋白质相互交联形成复合物。
这一步骤可以使用甲醛等交联剂进行。
2. 染色质免疫沉淀：将交联后的细胞或组织进行裂解，使DNA与蛋白质分离。
然后，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。
接着，使用磁珠或琼脂糖柱等材料，将抗原抗体复合物与其他非特异性结合的蛋白质和DNA分离。
3. 反交联：将抗原抗体复合物中的DNA与蛋白质进行反交联，使其分离。
这一步骤可以通过高温或酶切等方法进行。
4. DNA纯化：将反交联后的DNA进行纯化，去除杂质。
可以使用酚/氯仿等方法进行DNA的提取和纯化。
5. DNA测序：将纯化后的DNA进行高通量测序。
通过测序，可以得到大量的DNA片段序列。
6. 数据分析：对测序得到的数据进行分析，包括数据过滤、比对和富集分析等。
通过对数据的分析，可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并推测这些结合位点在基因调控中的功能。
三、应用1. 确定转录因子结合位点：转录因子是调控基因表达的关键蛋白质，chip-seq可以用来确定转录因子与DNA的结合位点。
通过分析转录因子的结合位点，我们可以了解基因调控网络的组成和功能。
2. 研究组蛋白修饰：组蛋白修饰是一种重要的基因调控机制，chip-seq可以用来研究组蛋白修饰与DNA的相互作用。
通过分析组蛋白修饰的分布情况，我们可以了解基因的激活或抑制状态。
3. 鉴定染色体可及性：染色体的可及性是指染色体上的DNA片段是否容易被蛋白质结合。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。
这样每100 ul溶液含1x106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5x106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4x106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
组织染色质免疫沉淀技术chip步骤
Chip环节组织裂解：1.新鲜组织。
切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。
加入10 ml of 1X PBS.3.加甲醛至终浓度为1%。
室温下转动15—20mins。
（10ul）4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。
4°C下转动10mins。
（0.5ml）5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。
用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。
离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。
匀浆机裂解组织。
1000 rpm，4°C ，离心5 min。
弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。
加入蛋白酶克制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) andleupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。
取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中旳蛋白酶克制剂。
冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。
（接下来第一天旳5）第一天1.细胞中加入1%旳甲醛，8ml旳培养液加入216 ul旳甲醛，37度十分钟。
2.配制具有蛋白酶克制剂旳PBS 20 ml和具有蛋白酶克制剂旳SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速旳移除含甲醛旳培养基，加入含蛋白酶克制剂旳PBS洗两遍。
胰酶消化20秒，加入含蛋白酶克制剂旳PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，搜集到1.5ml旳离心管里面。
4.4度rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶克制剂旳ＳＤＳ溶液。
吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一种新旳2ml旳离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后旳上清液到10X旳CHIP稀释液，200ul旳上清液加入1.8ml旳CHIP稀释液，到达最终体积2ml。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种用于研究转录调控的实
验方法。
它通过特异性抗体与染色质中的特定蛋白结合，然后利用免疫学的原理，将与目标蛋白结合的染色质分离出来。
这样就可以研究目标蛋白与染色质中的基因调控元件（如启动子、增强子等）之间的相互作用。
ChIP技术的基本步骤包括交联、染色质提取、染色质片断、
免疫沉淀、洗涤、脱交联和DNA提取。
其中交联步骤将细胞
中的染色质与蛋白交联在一起，使得它们之间的相互作用得以保持。
提取步骤则将交联后的细胞裂解，释放出染色质。
染色质片断步骤通过超声波处理或酶切等方法将染色质断裂成适当长度的片段，以便免疫沉淀能够更容易地进行。
免疫沉淀步骤通过将目标蛋白所结合的染色质与特异性抗体结合，然后用磁珠或蛋白A/G琼脂糖作为载体将免疫复合物沉淀下来。
洗涤
步骤则用于去除非特异性结合的染色质沉淀物。
最后，脱交联步骤通过加热或酶切等方法将染色质和蛋白的交联解开，使得免疫沉淀的DNA片段得以释放。
DNA提取步骤则是为了纯化目标DNA，以便进行后续的分析，如PCR、实时定量PCR、
测序等。
通过ChIP技术，研究者可以获取到与目标蛋白结合的染色质
片段，进而了解目标蛋白在染色质水平上的定位和互作关系，从而揭示转录调控机制的细节。
CHIP实验步骤
CHIP-qPCR实验步骤一、实验材料●主要试剂●主要仪器及器材二、实验步骤1. 细胞交联：a. 用1ml PBS重悬细胞；b.加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；c.加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；d.4℃，3000g，离心3min；弃上清液；e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。
f．重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；2. 胞核制备和染色质碎裂：a. 用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；b. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；c. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴30min，期间5min混匀一次；e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；g. 用100μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；h. 冰上超声打断5次，每次2min。
i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中3. 免疫沉淀：a. 取10ul上清作为input,-20℃冻存备用；b. 取90ul上清加入410ul X IP Dilution Buffer；阳性对照组加入10ul Anti-RNA Polymerase II Antibody，IP组加入10ug目的抗体；阴性对照组加入2μL IgG 。
c. 样本管放到翻转仪4℃翻转过夜孵育；d. 震荡混匀Protein A/G磁珠，并取20ul到每个实验组中；e. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；g．将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；h. 重复步骤f~g 3次；i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；j. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；4. 洗脱：a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，37℃震荡孵育30min；b.将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；d.各样本中分别加入6μL NaCl(5M) 、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);e. 65℃孵育2h;f. 使用DNA 纯化离心柱从样品中纯化DNA。
ChIP具体操作流程
ChIP具体操作流程ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究染色质蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
下面是ChIP的具体操作流程：1.细胞或组织处理：a.培养或收集要研究的细胞或组织。
b.如有需要，对细胞或组织进行处理，如刺激、药物处理等。
2.交联：a.向培养细胞或组织中加入足量的交联剂，如甲醛，使染色质与蛋白质交联。
b.在室温下轻轻摇动培养细胞或组织，使交联剂充分混合。
3.停止交联：a.加入甘氨酸或甘氨酸盐酸盐来中和剩余的交联剂。
b.在室温下继续摇动培养细胞或组织。
4.细胞或组织裂解：a.用裂解缓冲液裂解交联细胞或组织，释放出染色质。
b.在冰上孵育细胞或组织，使细胞或组织裂解。
5.染色质切割：a.使用限制性内切酶或超声波将染色质切割成较小的片段。
b.在室温下孵育样品，使切割反应进行。
6.免疫沉淀：a.加入特异性抗体（抗目标蛋白）到裂解的细胞或组织中，与目标蛋白结合。
b.在4℃下孵育样品，使抗体与目标蛋白结合。
c.加入蛋白A/G琼脂糖磁珠，使其与抗体-蛋白质复合物结合。
d.在4℃下孵育样品，使磁珠与抗体-蛋白质复合物结合。
7.洗涤：a.使用洗涤缓冲液洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白质和DNA。
b.重复洗涤步骤，至少洗涤3次。
8.去交联：a.加入适量的去交联缓冲液，去除染色质与蛋白质的交联。
b.在65℃下孵育样品，使染色质与蛋白质解交联。
9.DNA纯化：a.使用DNA提取试剂盒提取免疫沉淀后的DNA。
b.按照提取试剂盒的操作手册进行操作。
10.DNA定量和质检：a.使用紫外可见光谱仪或荧光光度计测量提取的DNA的浓度。
b.使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的大小和纯度。
11.DNA分析：a.使用PCR、实时荧光PCR、测序等方法对ChIP后的DNA进行分析。
b.根据需要选择适当的方法进行进一步的分析。
需要注意的是，不同实验室可能会有一些微小的差异或优化步骤，这些步骤可能根据具体实验要求而有所不同。
此外，ChIP实验是一个复杂的过程，需要仔细操作和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
ChIP基本流程图
ChIP基本流程图ChIP（染色质免疫沉淀）是一种用于研究蛋白质与染色质相互作用的实验技术。
下面是ChIP的基本流程图，以便更好地了解该技术的原理和步骤。
1.交联：首先，将细胞或组织交联。
这一步骤的目的是固定蛋白质-DNA复合物，以便后续的实验处理。
交联通常通过添加交联剂（如甲醛）来完成。
2.细胞裂解：将交联的细胞或组织裂解，以释放细胞核。
这可以通过机械破碎、化学裂解或超声波处理来完成。
裂解的目的是将染色质解离为小片段，以便后续的免疫沉淀步骤。
3.DNA切割：使用特定的限制酶或酶切剂切割DNA。
这一步骤的目的是产生适当大小的DNA片段，以便后续的免疫沉淀和测序分析。
4.免疫沉淀：将特定抗体与要研究的蛋白质结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白质的单克隆或多克隆抗体。
将抗体与它们所结合的蛋白质-DNA复合物一起孵育，以形成抗原-抗体复合物。
5.洗涤：使用缓冲液洗涤掉非特异性的蛋白质-DNA复合物，以去除非特异性结合的物质。
这一步骤的目的是减少背景噪音，提高实验的特异性。
6.反交联：通过加热或酶切等方法去除交联剂，以使蛋白质-DNA复合物解离。
这将使DNA片段从蛋白质中释放出来，以便后续的纯化和分析。
7.DNA纯化：纯化被免疫沉淀的DNA片段，以去除杂质。
这可以通过酚/氯仿提取、柱层析或磁珠纯化等方法完成。
8.DNA分析：对纯化的DNA片段进行进一步的分析。
这可以包括PCR扩增、测序、芯片分析或基因组定位等技术。
这些分析将帮助确定与特定蛋白质结合的DNA区域，并揭示蛋白质与基因调控之间的关系。
ChIP作为一种重要的基因组学技术，广泛应用于研究基因调控、表观遗传学和疾病发生机制等方面。
通过了解ChIP的基本流程，我们可以更好地理解该技术的原理和操作步骤，从而更好地利用它来解答科学问题。
CHIP(染色质免疫共沉淀)
一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。
洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。
染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation)(ChIP)详细实验流程及所需试剂
染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation)（ChIP）1. 细胞交联、裂解准备：42ml 1×PBS(4.2ml 10×PBS+37.8ml water)[预冷]SDS lysis Bufer 放置室温Protease inhibitor cocktailⅡ置室温新鲜配制37%甲醛(1). 向已长满细胞的10cmDish 中（含10ml培养基）加入275ul 37%甲醛，轻轻混匀，室温静置10min(2)．同时，准备2个EP管，每管中吸取1ml预冷的1×PBS，在分别加入5ul protease inhibitor cocktail Ⅱ,放置冰上。
(3)．加入1ml 10×Glycine 于每个Dish中，以中和多余的甲醛。
(4)．旋转混匀，室温放置5min(5)．将Dish放置冰上(6)．弃去培养基，尽可能吸尽培养基，不要损伤细胞。
(7)．加10ml预冷的1×PBS洗细胞(8)．弃PBS，再重复洗一遍(9)．加1ml预冷PBS（含有1 ×Protease inhibitor cocktailⅡ）与Dish中（2步准备好）(10)．将细胞刮下来，收集至EP管中。
(11)．700g，4℃，离心2-5min，使细胞沉淀下来。
(12)．在离心过程中，准备lysis buffer(1ml SDS lysis Bufer中加入5ul Protease inhibitor cocktailⅡ)一般1×107 Hele cell, 用1ml SDS lysis Bufer(13)．弃上清（细胞沉淀物可冻存与-80℃）(14)．1ml SDS(含1×Protease inhibitor cocktailⅡ)重悬细胞沉淀物(15)．分装300-400 ul每管（细胞裂解液可在-80℃保存）(16)．超声2. 超声剪切DNA(1)．分装5ul细胞裂解液，用于琼脂糖凝胶电泳（unsheared DNA）(2)．冰上放置细胞裂解液，超声剪切DNA注：（摸条件，超声时要将细胞裂解液放置冰上，超声时产生大量热，会破坏DNA）(3)．离心10000-15000g，4℃，10min，去除不容物(4）．取5ul琼脂糖凝胶电泳（sheared DNA）(5)．将余下上清分装于新的EP管中，每管100ul注：（每100ul中包括1×106 个细胞，可以用作一次免疫沉淀用量）剪切后的染色质可以储存与-80℃2个月久。
染色质免疫共沉淀技术原理
染色质免疫共沉淀技术原理一、前言染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是生物学研究中常用的一种方法，它通过利用抗体特异性识别染色质上的特定蛋白质，进而从复杂的细胞核提取物中富集这些蛋白质，并对其进行鉴定和分析。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理。
二、实验步骤1. 交联首先，需要对活细胞进行交联处理，以稳定染色质和蛋白质之间的相互作用。
常用的交联剂有甲醛和二氧化硅等。
2. 染色质片段化接下来，需要将交联后的细胞进行裂解，并将DNA片段化。
这可以通过超声波或者限制性内切酶等方法实现。
3. 免疫共沉淀然后，在裂解液中加入与目标蛋白特异性结合的抗体，并进行免疫共沉淀。
在共沉淀过程中，目标蛋白和与其结合的DNA片段会被富集到抗体上。
4. 分离DNA片段接下来，需要将DNA片段从抗体上分离出来。
这可以通过加入盐或者进行热处理等方法实现。
5. 鉴定和分析最后，对富集的DNA片段进行鉴定和分析。
这可以通过PCR扩增、测序或者芯片技术等方法实现，以确定目标蛋白在染色质中的作用位置和作用方式。
三、原理解析1. 抗体选择ChIP技术的核心是抗体的选择。
抗体需要特异性识别目标蛋白，并保持其活性。
通常情况下，使用多个不同来源的抗体可以提高富集效率和准确性。
2. 交联原理交联是通过甲醛或二氧化硅等化学物质与细胞核内的DNA、蛋白质发生共价结合而实现的。
交联后的染色质会更加稳定，避免了在裂解过程中DNA和蛋白质之间失去相互作用。
3. 片段化原理染色质片段化是为了将长链DNA切成适当大小的小片段，以便于后续步骤中与抗体结合并富集目标蛋白。
超声波法利用高频声波震荡使DNA分子破碎，而限制性内切酶法则利用特定的酶切割位点切割DNA分子。
4. 免疫共沉淀原理免疫共沉淀是利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合，将目标蛋白及其相关DNA片段从裂解液中富集到抗体上。
这一步骤需要注意选择合适的抗体和免疫共沉淀条件，以提高富集效率和准确性。
5. DNA片段分离原理将DNA片段从抗体上分离出来是为了进一步进行后续鉴定和分析。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。
但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。
此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。
例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
chipseq原理及流程
chipseq原理及流程ChIP-seq 流程包括样品处理、染色质免疫沉淀、DNA提取和准备、测序和数据分析阶段。
首先，样品处理包括准备细胞、核和染色质。
通过细胞生长、核提取和染色质交联等步骤，得到可以进行后续实验的样品。
接下来，进行染色质免疫沉淀。
这一步骤使用抗体特异性地选择性地沉淀与特定转录因子或组蛋白修饰结合的DNA片段。
一般而言，可以使用针对所研究蛋白的特异性抗体，将染色质中和蛋白相互作用的DNA序列捕获到特定的抗体上，从而实现染色质免疫沉淀。
然后，进行DNA提取和准备。
这一步骤涉及到将沉淀下来的染色质中的DNA片段进行纯化、修复和连接，以准备进行下一步的高通量测序。
通过这一过程，可以得到具有特定DNA序列的文库。
接下来，进行高通量测序。
这一步骤使用二代测序技术，对文库中的DNA序列进行测序。
通常可以选择使用Illumina技术进行测序，该技术能够高效地产生大量的短序列。
最后，进行数据分析。
这一步骤包括测序数据的处理和详细的生物信息学分析。
首先，测序数据需要进行质量控制和去除低质量序列。
然后，利用比对算法，将测序序列与参考基因组进行比对，以确定它们的起源和位置。
最后，通过统计分析和计算模型，可以鉴定特定转录因子或组蛋白在基因组上的结合位点和其附近的调控元件。
ChIP-seq技术的优点在于其高分辨率、高灵敏度和高通量测序的能力。
它可以帮助我们更好地了解蛋白与DNA相互作用的机制，识别转录因子、组蛋白修饰和表观遗传学调控在基因调控中的重要性。
总而言之，ChIP-seq技术为我们揭示染色质结构与功能之间的关系提供了有力的工具，为基因组学和生物医学研究提供了深入而广阔的透视。
CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol
CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。
其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。
实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。
实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。
实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。
实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。
2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。
3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。
4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。
5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。
注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。
常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。
总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。
同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
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Chip步骤
组织裂解：
1.新鲜组织。
切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。
加入10 ml of 1X PBS.
3.加甲醛至终浓度为1%。
室温下转动15—20mins。
（10ul）
4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。
4°C下转动10mins。
（0.5ml）
5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。
用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。
离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。
匀浆机裂解组织。
1000 rpm，4°C ，离心5 min。
弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。
加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) and
leupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins
9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。
取沉淀
10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。
冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。
（接下来第一天的5）
第一天
1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml
3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。
胰酶
消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。
吹打
重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，
达到最终体积2ml。
8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋
转30分钟。
9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。
10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。
（5—10大概一个小时）
第二天（1—8大概两个半小时）
1.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度
旋转一小时。
2.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
3.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
4.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
5.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
6.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次
7.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,
0.1M NaHCO3)。
加250ul elution buffer到沉淀，混匀后室温旋转15min。
1000rpm离心
3min沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约500ul。
8.加入20ul的5M的nacl反转交联，65度过夜。
第三天（大概3个小时）
1.加10µl的0.5M EDTA, 20µl的1M Tris-HCl, pH 6.5和2µl的10mg/ml的Proteinase K 到液
体。
45度旋转一小时。
2.加入等体积的苯酚/氯仿抽提ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集上清液，不要吸到丝
状蛋白。
3.加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠，沉淀ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集
沉淀，用７０%的酒精洗涤，开盖晾干。
4.用10ul的TE缓冲液溶解。
测浓度。
5.开机预热半个小时，加入200ml 的TE缓冲液调零,倒掉。
加入198ml的TE缓冲液和2ml
的样本，测260nm的吸光度。
得出值是ug/ul
6.PCR体系的配置
样本DNA 1ul
上游引物2ul
下游引物2ul
10xEasy tap buffer 5ul
100mM MgSO4 1ul
Easy Taq DNA Polymerase 0.5ul
加去离子水34.5ul
总体积50ul
PCR循环
94度5分钟
解链94度30秒
退火57度30秒
延伸72度1分钟
循环解链，退火，延伸。
35个循环
72度10分钟
琼脂糖凝胶鉴定
1．配制2.5%的琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖粉末加入20ml的液体中。
微波炉加热一分钟，冷却5分钟以上，冷却后加入eb，摇匀，倒入制胶模板中，十分钟以后凝固。
2．凝固后将其取出，放入电泳槽中，加样孔在负极端。
样本与6xbuffer按10ml样本和2ml buffer混匀后加样。
3．80伏稳压，电泳大约25分钟后取出，紫外下观察拍片。