组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤
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Chip步骤
组织裂解：
1.新鲜组织。切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。加入10 ml of 1X PBS.
3.加甲醛至终浓度为1%。室温下转动15—20mins。（10ul）
4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。4°C下转动10mins。（0.5ml）
5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。匀浆机裂解组织。1000 rpm，4°C ，离心5 min。弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) and
leupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins
9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。取沉淀
10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。（接下来第一天的5）
第一天
1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml
3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶
消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。吹打
重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，
达到最终体积2ml。
8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋
转30分钟。
9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。
10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。（5—10大概一个小时）
第二天（1—8大概两个半小时）
1.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度
旋转一小时。
2.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
3.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
4.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
5.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
6.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次
7.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,
0.1M NaHCO3)。加250ul elution buffer到沉淀，混匀后室温旋转15min。1000rpm离心
3min沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约500ul。8.加入20ul的5M的nacl反转交联，65度过夜。
第三天（大概3个小时）
1.加10µl的0.5M EDTA, 20µl的1M Tris-HCl, pH 6.5和2µl的10mg/ml的Proteinase K 到液
体。45度旋转一小时。
2.加入等体积的苯酚/氯仿抽提ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集上清液，不要吸到丝
状蛋白。
3.加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠，沉淀ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集
沉淀，用７０%的酒精洗涤，开盖晾干。
4.用10ul的TE缓冲液溶解。测浓度。
5.开机预热半个小时，加入200ml 的TE缓冲液调零,倒掉。加入198ml的TE缓冲液和2ml
的样本，测260nm的吸光度。得出值是ug/ul
6.PCR体系的配置
样本DNA 1ul
上游引物2ul
下游引物2ul
10xEasy tap buffer 5ul
100mM MgSO4 1ul
Easy Taq DNA Polymerase 0.5ul
加去离子水34.5ul
总体积50ul
PCR循环
94度5分钟
解链94度30秒
退火57度30秒
延伸72度1分钟
循环解链，退火，延伸。35个循环
72度10分钟
琼脂糖凝胶鉴定
1．配制2.5%的琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖粉末加入20ml的液体中。微波炉加热一分钟，冷却5分钟以上，冷却后加入eb，摇匀，倒入制胶模板中，十分钟以后凝固。2．凝固后将其取出，放入电泳槽中，加样孔在负极端。样本与6xbuffer按10ml样本和2ml buffer混匀后加样。
3．80伏稳压，电泳大约25分钟后取出，紫外下观察拍片。