产气荚膜梭菌检验作业指导书
产气荚膜梭菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验1范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；d）天平：感量0.1g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm×180mm；i）无菌培养皿：直径90mm；j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；k）厌氧培养装置。
3培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。
3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。
3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。
3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。
3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。
3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。
3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。
3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。
3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。
4检验程序产气荚膜梭菌检验程序见图1。
图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h 内不能进行检验，应以无菌操作称取25g （mL ）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2以无菌操作称取25g （mL ）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min ～2min ；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，作为1:10稀释液。
细菌产气荚膜梭菌培养鉴定技术流程介绍
细菌产气荚膜梭菌培养鉴定技术流程介绍下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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2019-食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌-文档资料
产气荚膜梭菌的生物学性状
3.生化特性 能发酵多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和
乳糖，产酸产气； 不发酵甘露糖或水杨酸。 能液化明胶，产生硫化氢，不能消化已凝固的
蛋白质和血清。
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二、产气荚膜梭菌的致病性
多种外毒素、肠毒素； 侵袭性酶：卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质
五、产气荚膜梭菌快速检测方法
随着产气荚膜梭菌分子生物学研究的深入， 该菌的毒素基因相继被克隆测序，在此基础上 出现了许多鉴定菌型和判断致病性的方法。
缩短了时间，能够较快得到结果，操作简单 比如PCR、LAMP等。
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六、产气荚膜梭菌的污染及控制
掌握产气荚膜梭菌血清型在我国地区流行的 分布以及在不同动物的感染致病情况是采取预 防控制措施的前提。
确证实验
3.取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基， 46℃水浴中培养2h，观察有无“暴烈发酵”现象， 5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固 酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基 不变黑。
4.用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板（每张平 板至少可接种10点），于36℃士1℃厌氧培养24h， 观察接种点的变化。产气英膜梭菌产生卵磷脂酶，分 解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色 的混浊带。
产气荚膜梭菌纯培养的镜下形态 电镜下的产气荚膜梭菌（C.perfringens）
产气荚膜梭菌的生物学性状
2.培养特性 生长活跃，代谢迅速。 血琼脂平板：双层溶血环（靶形溶血）
内环完全溶血 外环不完全溶血 含铁牛奶培养基： “汹涌发酵” （stormy fermentation）
血琼脂平板上的菌落形态
产气荚膜梭菌 国标检测方法
产气荚膜梭菌国标检测方法
《产气荚膜梭菌国标检测方法》
产气荚膜梭菌是一种在自然界中广泛分布的细菌，在土壤、水体和动植物表面等环境中都可能存在，同时也是人和动物的肠道正常菌群。
然而，产气荚膜梭菌也会引起食物中毒，对人体健康造成威胁。
因此，及时、准确地检测产气荚膜梭菌成为了食品安全监管的重要内容之一。
为了规范产气荚膜梭菌的国家标准检测方法，中国国家标准化管理委员会发布了《食品安全国家标准食品微生物检验鲜肉和肉制品、水产品及蛋品中产气荚膜梭菌检验》（GB 4789.9-2016）。
该标准规定了在食品中产气荚膜梭菌的检测方法及技术要求，其内容包括了样品制备、检测方法、结果判读和报告等方面。
在该标准中，样品制备包括了样品采集、致病菌分离培养和纯化等步骤；检测方法主要采用分子生物学技术和培养方法相结合的策略；结果判读则依据标准规定的指标和标准质控程序进行判定；报告部分则要求对检测结果进行详细的描述和解释。
此外，随着检测技术的不断更新和完善，国家标准化管理委员会也会不断修订和完善相关标准，以确保检测方法的准确性和适用性。
同时，食品生产企业也应当严格按照国家标准要求，对生产过程中的食品样品进行产气荚膜梭菌的检测，以保障食品的安全和质量。
总之，《产气荚膜梭菌国标检测方法》作为国家标准的一部分，对食品安全监管起着重要的作用，通过该标准的执行，可以有效避免食品中产气荚膜梭菌的污染，保障食品安全，保护消费者的健康。
矿泉水中产气荚膜梭菌检测能力验证经验
112 食品安全导刊 2020年5月T logy科技分析与检测1 矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证遇到的问题和解决方法2019年9月份参加矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证中遇到的问题：滤膜无黑色菌落产生，只有少量灰色和大量白色杂菌生长。
由于大量杂菌存在，导致确证试验中生化现象不明显，最终实验结果没有通过。
2019年12月份再次参加产气荚膜梭菌测量审核，综合研究GB 4789.13-2012 和GB 8538-2016及各方资料[1-2]，制定以下实验方案。
按照测量审核作业指导书，先把冻干粉水化得到的原液，然后进行10倍和100倍稀释，得到稀释液，对原液、稀释液进行检测。
方法1，取50 mL 样液用0.45 μm 滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，抽滤，做1个平板。
方法2，取50 mL 样液用0.22 μm 滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，抽滤，共2个平板。
方法3，取50 mL 样液用0.22 μm 滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，再覆盖一层SPS 培养基，抽滤，做1个平板。
方法4，取50 mL 样液用0.22 μm 膜抽滤，然后将滤膜反贴在SPS 平板上，即抽滤面朝下，抽滤，做1个平板。
方法5，取50mL 样液用0.22μm 膜抽滤，然后将滤膜正贴在TSC 平板上，抽滤，做1个平板。
同时做阴阳性对照，将以上平板在（36±1）℃下厌氧培养24 h，结果如表1所示。
验证试验，挑取各种形态不同的菌落做生化检验，验证试验结果：所有菌落都可以在FTG 旺盛生长；透明白色的菌落生化指标都不符合；灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指标全部符合，也有部分菌的生化指标部分符合，可能是杂菌太多，挑取菌落时带有杂菌。
结果报告：参考实验中方法2的灰色菌落（136、146灰）和方法5的黑色菌落数（173黑）的数据，报了140 矿泉水中产气荚膜梭菌检测能力验证经验□ 徐万丽 深圳市通量检测科技有限公司摘 要：产气荚膜梭菌（C.perfringens）又称魏氏梭菌，厌氧芽孢杆菌属。
第十节产气荚膜梭状芽孢杆菌检验ppt课件
Clostridium perfringens
/shouyiweisheng wu/图片资料/产气荚膜梭菌.jpg
2019
www.uni-ulm.de/.../ Diagnostik/Erreger/c_keim.htm -
5
2)培养特性
*不严格的厌氧 *普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。 *适宜生长温度为37—47℃。 *生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 *在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h 传种1次，较易分离纯化。
第十节 产气荚膜梭菌检验
魏氏梭菌
食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验
Microbiological examination of food hygiene Examination of Clostridium perfringens
2019
-
1
目录
1、概述 2、生物学特性
（菌体形态学特征、 培养特性和抵抗力）
2019 3
2、生物学特性
1)形态与染色
G+( 陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽 胞的大杆菌 大小：为(1－2)μm X(2－10)μm 。 芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。 荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基 内生长时可形成荚膜。
2019 4 /research/Images/SarkerSlide.jpg / research/micimm/index.php
Clostridium Perfringens Toxin
2019 /.../ agents/AgentsBW_toxins.asp 6 -
肝片肉汤培养： －－大量产气，培养5h-6h变浑浊； 牛奶培养基中生长： －－能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固 产生大量气体，冲散酪蛋白， 使其成海绵状。 庖肉培养基中培养： －－产生大量气体，肉渣或肉块 略带粉红，但不消化。 普通琼脂平板上培养： －－15h－ 24h形成S型菌落， 在营养不足或琼脂浓度 高的平板上可形成锯齿状带 at 45C ， ClostridiumR perfringens is virtually the only 放射条纹的 型菌落。
产气荚膜梭菌检验标准操作程序
产气荚膜梭菌检验标准操作程序产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种产生有毒代谢产物的革兰氏阳性厌氧菌，常见于土壤、粪便和人体肠道中。
其毒素可引起严重的食物中毒和其他感染性疾病，因此对产气荚膜梭菌的监测和检验至关重要。
1.引言产气荚膜梭菌是一种广泛分布且致病力强的细菌，在食品安全和公共卫生领域具有重要意义。
为了确保食品的安全性和卫生标准，需要对食品、环境和临床标本中的产气荚膜梭菌进行检验。
本文将介绍产气荚膜梭菌检验的标准操作程序，并探讨其中的关键步骤和注意事项。
2.标本采集在进行产气荚膜梭菌检验之前，首先需要采集样本。
对于食品样品，可以直接将样品取样放入含有富集培养基的袋子中。
对于环境样品和临床样本，应当使用消毒的采样器具采集，并立即送至实验室进行处理。
3.富集培养采集到的样品需要进行富集培养，以增加产气荚膜梭菌的数量。
将样品转移到含有适当营养物质的培养基中，利用合适的条件（如温度、气氛）进行培养。
通常，产气荚膜梭菌在厌氧条件下生长较好，因此富集培养应当在无氧或低氧环境中进行。
4.筛选经过富集培养后，需要进行筛选，以确定样品中是否存在产气荚膜梭菌。
常用的方法包括置换培养、差异培养和生化试剂检验。
通过观察菌落形态、产气能力和代谢产物等指标，可以初步筛选出产气荚膜梭菌。
5.鉴定对于筛选出的潜在产气荚膜梭菌菌株，需要进行进一步的鉴定。
主要包括形态学观察、生理生化特性检验和分子生物学方法。
通过对其细胞形态、营养需求和基因序列等特征的分析，可以准确鉴定产气荚膜梭菌。
6.毒素检测产气荚膜梭菌引起食物中毒的主要机制是其产生的毒素。
因此，在检验过程中，还需要对样品中的毒素进行检测。
常用的方法包括毒素中和试验、免疫测定和PCR检测。
通过这些方法，可以确定样品中毒素的种类和含量。
7.结果分析最终，根据样品中产气荚膜梭菌的数量和毒素水平，对检验结果进行分析。
根据相关标准和法规，确定样品是否符合卫生安全要求。
产气荚膜梭菌检验作业指导书
品有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。
2 适用范围适用于产气荚膜梭菌检测。
3 术语产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。
属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。
无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。
4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图无6 作业内容6.1 检验方法原理微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22µm、0.45µm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。
6.2 实验器材、培养基及试剂6.2.1 实验器材不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22µm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。
6.2.2培养基及试剂庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液6.3操作步骤6.3.1推测性检验6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。
6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好品有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页滤器，将50mL水样或稀释液通过孔径0.22µm的滤膜过滤。
产气荚膜梭菌检验标准操作程序
产气荚膜梭菌检验标准操作程序As the development of science and technology advances, the testing standards and procedures for Clostridium difficile (C. diff) have become more refined and rigorous. 随着科学技术的进步，产气荚膜梭菌(C. diff)的检测标准和程序变得越来越精细和严格。
When it comes to the detection of C. diff, it is essential to follow standardized operating procedures to ensure accurate and reliable results. 检测C. diff时，遵循标准化的操作程序至关重要，以确保结果准确可靠。
One of the critical steps in the testing process is sample collection. Proper sample collection is crucial for obtaining accurate results. 检测过程中一个关键的步骤是样品采集。
正确的样品采集对于获得准确的结果至关重要。
In addition to sample collection, sample transportation and storage are also vital aspects of the testing procedure. Proper transportation and storage conditions help preserve the integrity of the sample and prevent contamination or degradation. 除了样品采集外，样品的运输和储存也是检测过程中至关重要的方面。
GB产气荚膜梭菌检测
2
《GB 4789.13—2012 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌 检验 》
3
《GB 4789.13—2012 食品微生物学检验 产气荚膜梭 菌检验 》解决方案
用途 样品制备 GB中的名称 1%蛋白胨水 OXOID的英文名称 Peptone Bacteriological OXOID的中文名称 细菌学蛋白胨 OXOID货号 LP0037B
计数培养
Perfringens Agar 胰胨-亚硫酸盐-环丝 Base (TSC/SFP) 氨酸（TSC）琼脂 Perfringens（TSC） Supplement 液体硫乙醇酸盐培养 Thioglycollate Medium 基（FT）
产气荚膜梭菌 CM0587B TSC/SFP 琼脂基础 产气荚膜梭菌TSC 添 SR0088E 加剂 硫乙醇酸盐培养基 CM0173B CM0173T
GB 产气荚膜梭菌检测
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）
• 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是革兰氏阳性杆状厌氧 菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖 类而产出大量气体以及可以在体内能 形成荚膜而得名。 • 严格厌氧，对营养要求不高，厌氧培 养中生长繁殖极快。 • 此菌多以芽胞形式广泛分布于土壤、 人及动物肠道中。引起食物中毒的食 品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶 也可因污染而引起中毒。
确认试验
革兰氏染色液
Gram Stain Kit
革兰氏染色液套装
R400804ຫໍສະໝຸດ 结果观察• 培养：
典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
• 确证实验：
从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种 到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚 膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。 含铁牛乳培养基：暴烈发酵 缓冲动力-硝酸盐培养基：产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。 乳糖-明胶培养基：产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。
产气荚膜梭状芽孢杆菌检验-文档资料
2)培养特性
*不严格的厌氧 *普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。 *适宜生长温度为37—47℃。 *生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 *在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h 传种1次，较易分离纯化。
Clostridium Perfringens Toxin
2、生物学特性
1)形态与染色
G+( 陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽 胞的大杆菌 大小：为(1－2)μm X(2－10)μm 。 芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。 荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基 内生长时可形成荚膜。
Clostridium perfringens
/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.ht
/courses/bio141/labmanua/lab 16/bloodcp.html/.../ labmanua/lab16/bloodcp.html
Clostridium perfringens Growing on Blood Agar
amozeshonline/bacteriolog y/archives/2019/09/uuoeoeo euoeuuu.html/.../ 09/uuoeoeoeuoeuuu.html
1、概述
产气荚膜梭状芽孢杆菌 又称魏/卫氏梭菌 分布：自然界广泛存在(创伤感染）。 易污染食品：动物性食品原料 食品加热后未及时冷却，所含耐高温而 残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量 繁殖，菌数可达数 10 万 /g ，食用前又未加热， 则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。 食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是 检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是 活菌数测定及证实试验。
MMFSCNJ出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法
MM_FS_CNJ_0341出口食品产气荚膜梭状芽孢杆菌平板计数法MM_FS_CNJ_0341出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）胰月示.－亚硫酸盐－环丝氨酸（TSC）琼脂；D－环丝氨酸溶液；卵黄乳液；缓冲动力－硝酸盐培养基；乳糖－明胶培养基；产芽孢肉汤；多价蛋白胨－酵母膏（PY）培养基；硫乙醇酸盐液体培养基；蛋白胨水；亚硝酸盐试剂；缓冲甘油－氯化钠溶液。
2.2.仪器吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；超低温冰箱；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴箱：46±1℃；培养皿：90或100mm；显微镜。
3.过程简述3.1.样品制备3.1.1.样品的贮存和运送如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油－氯化钠溶液（液体食品应加双料的）。
将样品作低温保存，直到检验，运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容器破损。
3.1.2.制样将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13000r／min 均质2min，如为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1∶10样品匀液10mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1∶100样品稀释液，必要时，按此法将样品作进一步的倍递增稀释，如从10－3～10－4……。
3.2.检验3.2.1.平板计数法倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。
当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心。
再向平皿中倾注不含卵黄的TSC 琼脂15mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。
也可用灭菌L形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5～10min，使接种物被吸收。
第十节产气荚膜梭状芽孢杆菌检验
鲜血琼脂平板生长： －－菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外 层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄 色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能 逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特 征之一。
Clostridium perfringens bacteria on a blood agar plate Courtesy Glenn Songer, The University . of Arizona College of Agriculture and Life Sciences.
3) 生化特性
*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，
*液化明胶
*还原硝酸盐为亚硝酸盐。
*能将亚硫酸盐还原为硫化物， 在含亚硫酸盐及铁盐 的琼脂中形成黑色菌落
*发酵牛奶中 的乳糖，使牛奶 凝固，同时大量 产气，凝块碎裂， 即所谓‘‘暴风 雨式发酵”，这 是本菌的重要生 化特征之一，也 是鉴别的主要指 标。
传种1次，较易分离纯化。
Clostridium Perfringens Toxin
/.../ agents/AgentsBW_toxins.asp
肝片肉汤培养： －－大量产气，培养5h-6h变浑浊；
牛奶培养基中生长： －－能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固 产生大量气体，冲散酪蛋白， 使其成海绵状。
： / articles/01_02/Clos...
Clostridium perfringens shows double-zone hemolysis on blood agar. Note the small area of beta hemolysis (complete lysis of red blood cells) surrounded by a larger zone of alpha hemolysis (partial hemolysis). The plate is sitting on a black lab bench
产气荚膜梭菌分离、鉴定作业指导书
产气荚膜梭菌分离、鉴定作业指导书一、操作步骤1.1活菌计数培养1.1.1按无菌操作称取食品检样25g(mL)放入均质器，加0.1%蛋白陈水稀释剂225mL，低速搅动1～2min，使之均质化，作为1∶10稀释液。
1.1.2以上述1∶10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈稀释剂9mL做成10-2～10-6的系列稀释液。
1.1.3吸取各稀释液1mL分别放入2个灭菌平皿内。
每个平皿浇注约50℃的SPS琼脂15～20mL，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
1.1.4上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于36±1℃培养24h。
1.1.5选取长有30～300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。
1.2确证试验1.2.1由平板上任取10个黑色菌落，分别按种FT培养基，于36±1℃培养18～24h。
1.2.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检。
产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。
1.2.3用接种环(针)穿刺接种动力－硝酸盐培养基，于36±1℃培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。
然后，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL，观察硝酸盐是否被还原。
产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
1.2.4取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象，5h内不发酵者为阴性。
产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
1.2.5用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每张平板至少可接种10点)，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种点的变化。
产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。
二、菌数计算根据黑色菌落的计数(6.1.5)和确证试验的结果(6.2)，计算每克(毫升)食品检样的含菌数。
产气荚膜梭菌检验
γ毒素(DNA酶)能使细胞核DNA解聚，降低 坏死组织的粘稠度。
二. 毒素和酶类
㈡ 肠毒素
A型产气荚膜梭菌的耐热菌株能引起食物中毒。 产气荚膜梭菌肠毒素是一种蛋白质毒素，其
抗原性均一的，分子量 33000～40000，等电 点pH4.3。该毒素耐热性较弱，60℃10分钟加 热即可破坏；对碱有抵抗性，而在 pH4.0以 下的介质中极不稳定；对胰蛋白酶、胰凝乳 酶、木瓜酶等蛋白分解酶比较稳定。
↓ 食物消费后
↓ 引起食物中毒
产气荚膜梭菌的污染及控制
掌握产气荚膜梭菌血清型在我国地 区流行的分布以及在不同动物的感染致 病情况是采取预防控制措施的前提。
防治原则 及时清创，破坏和消除厌氧微环境 食物加热彻底
六. 流行病学
七. 检验程序
(1)培养基和试剂
(2)产气荚膜梭菌 检验程序:
检样 25g(ml)检样＋225ml 0.1％蛋白胨水稀释液
二. 毒素和酶类
㈠ 外毒素
α毒素，为卵磷脂酶，能分解人和动物细 胞膜上磷脂和蛋白质的复合物，破坏细胞膜， 引起溶血、组织坏死和血管内皮损伤，使血 管通透性增高，造成水肿。还能促使血小板 凝聚，导致血栓形成，局部组织缺血。
β毒素引起人类坏死性肠炎。
ε毒素有坏死和致死作用。
二. 毒素和酶类
θ毒素有溶血和破坏白细胞作用，对心肌有 毒性。 κ毒素(胶原酶)能分解肌肉和皮下的胶原 组织，使组织溶解。
革兰阳性粗短大杆菌，专性厌氧。 无鞭毛，不能运动,体内有明显荚膜。 单独或成双排列，有时也可成短链排列。
芽胞呈卵圆形，芽胞宽度不比菌体大， 位于中央或末次端。培养时芽胞少见， 须在无糖培养基中才能生成芽胞。在脓 汁、坏死组织或感染动物脏器的涂片上，
产气荚膜梭菌及检验
产气荚膜梭菌及检验一、流行病学产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。
可引起典型的食物中毒、爆发。
由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。
患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。
摄食被本菌污染的食品后8�22小时开始发病。
在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1�2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。
据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。
例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。
产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。
产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽胞能耐受100℃,1�5小时的加热。
除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。
产气荚膜梭茵的检验
产气荚膜梭茵的检验摘要】目的研究产气荚膜梭茵的检验方法。
方法分析其生态、生物学性状、致病性与免疫性、微生物学检验等。
结论要提高产气荚膜梭茵的检出率，要在多个环节上加以重视，严格按照操作规程，才能提高检出率，有效地治疗厌氧菌引起的化脓性炎症，使患者早日康复。
【关键词】产气荚膜梭茵检验产气荚膜梭菌(c.peueringens)，又名魏氏梭菌(c.welchii)，它是引起气性坏疽的病原菌群之一。
(一)生态产气荚膜梭菌广泛地分布于自然界，尽管它在人畜肠道中数量不大，约104～105/g，但它是人畜肠道正常菌群之一。
此菌对人致病的主要为A型和c型。
A型产气荚膜梭菌是土壤及肠道菌群成员之一，而B、C、D、E型菌可能是动物专性栖生菌，偶尔在人体内发现。
本菌可从食物、牛奶、奶酪或包装不合格的肉食及野味中分离，在人体中除了口腔外，子宫颈、阴道、尿道、消化道中也可分离到，1/5人群还可能从前肘窝皮肤分离到此菌。
A型产气荚膜梭菌参与气性坏疽致病。
(二)生物学性状1.形态产气荚膜梭菌是革兰染色阳性粗大杆菌，约为0.6～2.4μm×1.3～1.9(或3～5)μm，无鞭毛，不运动，直杆菌，两端纯圆，单个或成双排列，偶见长丝状。
芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于茵体。
在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有。
2.培养厌氧，但要求不严格。
繁殖迅速，培养2 h后，在液体培养基深层即有明显生长，经4～6 h培养后出觋表面生长，在平板培养基上24 h培养，表面蔼落直径2～4，霭形、凸起，光滑、半透明、边缘整齐，无迁徙生长现象。
在血平板上，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血是由于0毒素的作用，外环不完全溶血则是由α毒素所致。
在卵黄琼脂平板上，菌落周围出现乳白色混浊圈，是由于此菌所产生的卵磷脂酶分解了蛋黄中的卵磷脂，此现象可被特异性抗血清所中和，这一现象称为聂格尔(Nagler)反应，对于菌株的确定有决定性意义。
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1 目的
规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。
2 适用范围
适用于产气荚膜梭菌检测。
3 术语
产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。
属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。
无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。
4 职责
质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图
无
6 作业内容
6.1 检验方法原理
微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22µm、0.45µm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。
6.2 实验器材、培养基及试剂
6.2.1 实验器材
不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22µm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。
6.2.2培养基及试剂
庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液6.3操作步骤
6.3.1推测性检验
6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。
6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好
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页码：第2页，共2页滤器，将50mL水样或稀释液通过孔径0.22µm的滤膜过滤。
6.3.1.3将过滤后的滤膜贴在已制备好的SPS琼脂平板（截留面朝上），然后倒置于36±1℃
厌氧培养装置培养24h。
6.3.1.4平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
6.3.2计数
产气荚膜梭菌菌落在滤膜上呈现大小不等的黑色菌落。
将可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查等确认性试验，产气荚膜梭菌应为革兰氏阳性粗大杆菌。
计数每50mL水样中的产气荚膜梭菌菌落数。
6.3.3确证性试验
6.3.3.1接种
将SPS琼脂平板上生长的可疑黑色菌落接种于FT培养基，36±1℃培养18～24h，然后进行下列试验。
6.3.3.2革兰氏染色
革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热菌株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。
6.3.3.3动力硝酸盐试验
穿刺接种动力硝酸盐培养基，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。
滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各1～2滴，观察硝酸盐是否被还原。
产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
若培养基变为红色，则为动力硝酸盐阳性反应。
6.3.3.4牛奶发酵试验
取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛奶培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在5h内不发酵者为阴性，产气荚膜梭菌能发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
6.3.4 结果报告
根据黑色菌落的计数和确证性试验为阳性的结果，计算每50mL水样中的产气荚膜梭菌数量，结果以CFU/50mL计。
7 相关文件
7.1 《饮用天然矿泉水检验方法》
8 相关记录
无。