焦磷酸测序技术的原理(2020年整理).pptx
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2.5 焦磷酸测序固相单链模板的制备 取 5 μL 戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。磁珠以 100 μL B&W Buffer(10 mmol/L Tris HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗涤两遍，最终悬浮于 50 μL B&W 缓冲液中;加入 50 μL PCR 产物，37℃反应 30 min;用磁铁吸弃上清液，磁珠以 180 μL H2O 洗涤两遍，加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 20 μL，混匀室温放置 5 min 使 PCR 产物变性; 磁铁吸弃上清液，磁珠以 100 μL B&W 缓冲液洗涤两遍，100 μL 1×退火缓冲液洗一遍，最
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Pyrosequencing 技术的原理 Pyrosequencing 是一项全新的 DNA 测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本 原理如下： 第 1 步：1 个特异性的测序引物和单链 DNA 模板结合，然后加入酶混合物（包括 DNA Polymerase、 ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase）和底物混合物（包括 APS 和 Luciferin）。 第 2 步：向反应体系中加入 1 种 dNTP,如果它刚好能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚 合酶的作用下，添加到测序引物的 3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
1引 言 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用 于检测基因表达水平的技术主要有SAGE 法[1]、实时荧光定量 PCR 法[2,3]和基因芯片法[4] 等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等 缺点。 焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要 使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微 生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析， 考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1 基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的 差异表达。
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终溶于 8 μL 1×退火缓冲液中;加入 1 μL 10 μmol/L 测序引物，93 ℃混匀 30 s，55 ℃退火 3 min，4 ℃保存，待测序用。
2.6 焦磷酸测序反应 焦磷酸测序标准混合液的组成为：0.1 mol/L Tris Ac 缓冲液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA， 10 mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′ 磷酸化硫酸 腺苷(adenosine 5′ phosphosulfate，APS)，0.4 μg/L PVP，0.4 mmol/L D 虫荧光素， 2×10-4 U/L 三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L 无外切 酶活性的Klenow DNA 聚合酶，14.6 mg/L 荧光素酶。
第 2 步图示(图片来自互联网) 第 3 步：在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 结合形成 ATP;在荧光素酶的催化下，生成 的 ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过 CCD 光学系统即可获得一个特异 的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
3.2 焦磷酸测序的定量特性
在同一焦磷酸测序反应体系中，产生的荧光信号强度与 ATP 的量成正比，而 ATP 的量 与聚合的 dNTP 个数成正比，所以可以根据图谱中测得的信号强度推测出模板 DNA 相对含 量。为了验证焦磷酸测序的定量特性，人为设计了一条测序单链(5′ GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC 3′ )和一条测序引物(5′ GCGGGCGGGG 3′)，使测序单链的 3′端与测序 引物单链的 5′端完全互补。两条单链退火后按 dTTP→dGTP→dATPαS→dCTP 的顺序循环 递加dNTP进行测序反应。结果显示，待测模板上测序引物的延伸序列为“T G A C TT GG AA CC”12 个碱基，其信号强度跟同质区的相同碱基个数成正比。这一结果表明，峰强度与被 引物延伸模板的量成正比，可通过测定各峰的峰高之比确定对应的模板的相对含量。本研 究 利用焦磷酸测序技术的定量特性，通过测序图谱中的峰高比值分析不同来源的基因相对 表达 量。
第 3 步图示(图片来自互联网) 第 4 步：反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下发生降解。
第 4 步图示(图片来自互联网) 第 5 步：加入另一种 dNTP,使第 2-4 步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信 息。
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第 4 步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing 技术操作简单，结果准确可靠，可应用于 SNP 位点检测、等位基因频率测定、细菌和 病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善，请 上一篇下一篇
实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。
2.2 RNA 的提取
用 Trizol 试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA 浓度及纯度。
2.3 反转录合成 cDNA 第一链 取等量的不同来源的总 RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总 RNA 0.05～2.0 μg 至 Nuclease free 的小管中，加 DEPC H2O 至 12 μL;65 ℃反应 5 min 后， 置冰上至少 1 min;在上述各小管中加入 10×第一链合成缓冲液 2 μL，0.5 mmol/L dNTP 混 合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L 反转录 引物，加 DEPC H2O 至总体积为 20 μL。反转录条件为：37℃ 反应 1 h, 93 ℃反应 5 min， 然后中止反应。
2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料 21R 型台式高速冷冻离心机(美国Beckman 公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日 本 Naka Instrument 公司);PTC 225 PCR 扩增仪、Opticon 实时荧光 PCR 仪(美国 MJ
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Research 公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。此装置主要由焦磷酸测序反 应模块、荧光信号放大和数据采集 3 部分组成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管 与四周的 dNTP 储液池相连组成。通过注射器施压使 4 种 dNTP 循环加入反应池完成测序 反应。荧光信号通过R6335 光电倍增管(日本 Hamamatsu Photonics K.K.公司)放大后，经 BPCL 微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。
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何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR 产物制备成单链，根据来源特异性反 转录引物中来源标签序列进行焦磷酸测序。测序结果中，各来源特异性碱基的相对峰高即 代 表相对基因表达量差异。本方法称之为 SRPP 法(Sequence tagged reverse transcription PCR with pyrosequencing)。
具体事例
【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对 基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录 标记上特异性标签，PCR 后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的 序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量 PCR 法 对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP 可以同时准确测定同一基因在 3 个不同来 源中的表达量，并实际测定了Egr1 基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】 序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达
Hotstar Taq DNA 聚合酶、Omniscript RT kit 反转录试剂盒(德国 Qiagen 公司);Trizol(上 海 Inviotrogen 公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和 5′ 磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma 公司); Dynabeads M 280 链霉亲和素磁珠(挪威 Dynal AS 公 司); Klenow DNA 聚合酶(美国Promega 公司);所有引物均由上海 Invitrogen 公司合成。
2.4 基因特异性PCR 不同来源的cDNA 等比例混合，以共用引物CP(5′ CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC 3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。PCR 体系为： cDNA 等比例 混 合液 1 μL， 0.3 μmol/L CP 和 GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物， 10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液 10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA 聚合酶，并加入灭菌 蒸馏水至 50 μL。PCR 反应程序为： 94 ℃ 变性 15 min，热循环 35 次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )， 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。基因特异性引物的序列见表 1。表 1 实验用引物
3 结果与讨论
3.1 方法原理 焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技 术。其原理是：引物与模板 DNA 退火后, 在 DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸 化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用 下完成循环测序反应。当加入的 dNTP 与模板互补时，DNA 模板与互补的dNTP 聚合可以 产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi 与 5′ 磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生 成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP 与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。产生的荧 光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的 dNTP 类型和测得的荧光信 号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。反应方程式如下：
具体测定过程如图 1 所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA 进行反转 录。引物由 4 部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的 4 个碱基为人为设计的来源特异 性标签，在图 1 中以深浅不同的 4 个小圆点表示;3′端为 oligo(dT)n 和用于固定 oligo(dT)n 位置的两个兼并碱基。来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来 源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的 cDNA 稀释后等比例混合;(3) 用生物素 标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行 任
ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5) 为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结 合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序 列进行解码和定量测定。采用反转录引ห้องสมุดไป่ตู้将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后 用 焦磷酸测序定量测定标记序列。
(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)
PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)
ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)
dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)
图 1 碱基序列标记法结合焦磷酸测序解码技术测定基因表达量差异的原理图
Fig.1 Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequence tagged reverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同来源的同一基因在单管中只用一对引物进行 PCR，并且 扩增产物的碱基组成和含量完全一样，仅 4 个碱基的排列顺序不一样，具有相同的保留时 间。所以来源不同，表达量不同的同一基因在单管中能实现等比例扩增。SRPP 测定峰高比 值也即能代表起始基因的相对表达量。
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Pyrosequencing 技术的原理 Pyrosequencing 是一项全新的 DNA 测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本 原理如下： 第 1 步：1 个特异性的测序引物和单链 DNA 模板结合，然后加入酶混合物（包括 DNA Polymerase、 ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase）和底物混合物（包括 APS 和 Luciferin）。 第 2 步：向反应体系中加入 1 种 dNTP,如果它刚好能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚 合酶的作用下，添加到测序引物的 3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
1引 言 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用 于检测基因表达水平的技术主要有SAGE 法[1]、实时荧光定量 PCR 法[2,3]和基因芯片法[4] 等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等 缺点。 焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要 使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微 生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析， 考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1 基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的 差异表达。
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终溶于 8 μL 1×退火缓冲液中;加入 1 μL 10 μmol/L 测序引物，93 ℃混匀 30 s，55 ℃退火 3 min，4 ℃保存，待测序用。
2.6 焦磷酸测序反应 焦磷酸测序标准混合液的组成为：0.1 mol/L Tris Ac 缓冲液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA， 10 mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′ 磷酸化硫酸 腺苷(adenosine 5′ phosphosulfate，APS)，0.4 μg/L PVP，0.4 mmol/L D 虫荧光素， 2×10-4 U/L 三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L 无外切 酶活性的Klenow DNA 聚合酶，14.6 mg/L 荧光素酶。
第 2 步图示(图片来自互联网) 第 3 步：在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 结合形成 ATP;在荧光素酶的催化下，生成 的 ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过 CCD 光学系统即可获得一个特异 的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
3.2 焦磷酸测序的定量特性
在同一焦磷酸测序反应体系中，产生的荧光信号强度与 ATP 的量成正比，而 ATP 的量 与聚合的 dNTP 个数成正比，所以可以根据图谱中测得的信号强度推测出模板 DNA 相对含 量。为了验证焦磷酸测序的定量特性，人为设计了一条测序单链(5′ GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC 3′ )和一条测序引物(5′ GCGGGCGGGG 3′)，使测序单链的 3′端与测序 引物单链的 5′端完全互补。两条单链退火后按 dTTP→dGTP→dATPαS→dCTP 的顺序循环 递加dNTP进行测序反应。结果显示，待测模板上测序引物的延伸序列为“T G A C TT GG AA CC”12 个碱基，其信号强度跟同质区的相同碱基个数成正比。这一结果表明，峰强度与被 引物延伸模板的量成正比，可通过测定各峰的峰高之比确定对应的模板的相对含量。本研 究 利用焦磷酸测序技术的定量特性，通过测序图谱中的峰高比值分析不同来源的基因相对 表达 量。
第 3 步图示(图片来自互联网) 第 4 步：反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下发生降解。
第 4 步图示(图片来自互联网) 第 5 步：加入另一种 dNTP,使第 2-4 步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信 息。
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第 4 步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing 技术操作简单，结果准确可靠，可应用于 SNP 位点检测、等位基因频率测定、细菌和 病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善，请 上一篇下一篇
实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。
2.2 RNA 的提取
用 Trizol 试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA 浓度及纯度。
2.3 反转录合成 cDNA 第一链 取等量的不同来源的总 RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总 RNA 0.05～2.0 μg 至 Nuclease free 的小管中，加 DEPC H2O 至 12 μL;65 ℃反应 5 min 后， 置冰上至少 1 min;在上述各小管中加入 10×第一链合成缓冲液 2 μL，0.5 mmol/L dNTP 混 合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L 反转录 引物，加 DEPC H2O 至总体积为 20 μL。反转录条件为：37℃ 反应 1 h, 93 ℃反应 5 min， 然后中止反应。
2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料 21R 型台式高速冷冻离心机(美国Beckman 公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日 本 Naka Instrument 公司);PTC 225 PCR 扩增仪、Opticon 实时荧光 PCR 仪(美国 MJ
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Research 公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。此装置主要由焦磷酸测序反 应模块、荧光信号放大和数据采集 3 部分组成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管 与四周的 dNTP 储液池相连组成。通过注射器施压使 4 种 dNTP 循环加入反应池完成测序 反应。荧光信号通过R6335 光电倍增管(日本 Hamamatsu Photonics K.K.公司)放大后，经 BPCL 微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。
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何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR 产物制备成单链，根据来源特异性反 转录引物中来源标签序列进行焦磷酸测序。测序结果中，各来源特异性碱基的相对峰高即 代 表相对基因表达量差异。本方法称之为 SRPP 法(Sequence tagged reverse transcription PCR with pyrosequencing)。
具体事例
【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对 基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录 标记上特异性标签，PCR 后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的 序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量 PCR 法 对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP 可以同时准确测定同一基因在 3 个不同来 源中的表达量，并实际测定了Egr1 基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】 序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达
Hotstar Taq DNA 聚合酶、Omniscript RT kit 反转录试剂盒(德国 Qiagen 公司);Trizol(上 海 Inviotrogen 公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和 5′ 磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma 公司); Dynabeads M 280 链霉亲和素磁珠(挪威 Dynal AS 公 司); Klenow DNA 聚合酶(美国Promega 公司);所有引物均由上海 Invitrogen 公司合成。
2.4 基因特异性PCR 不同来源的cDNA 等比例混合，以共用引物CP(5′ CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC 3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。PCR 体系为： cDNA 等比例 混 合液 1 μL， 0.3 μmol/L CP 和 GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物， 10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液 10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA 聚合酶，并加入灭菌 蒸馏水至 50 μL。PCR 反应程序为： 94 ℃ 变性 15 min，热循环 35 次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )， 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。基因特异性引物的序列见表 1。表 1 实验用引物
3 结果与讨论
3.1 方法原理 焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技 术。其原理是：引物与模板 DNA 退火后, 在 DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸 化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用 下完成循环测序反应。当加入的 dNTP 与模板互补时，DNA 模板与互补的dNTP 聚合可以 产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi 与 5′ 磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生 成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP 与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。产生的荧 光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的 dNTP 类型和测得的荧光信 号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。反应方程式如下：
具体测定过程如图 1 所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA 进行反转 录。引物由 4 部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的 4 个碱基为人为设计的来源特异 性标签，在图 1 中以深浅不同的 4 个小圆点表示;3′端为 oligo(dT)n 和用于固定 oligo(dT)n 位置的两个兼并碱基。来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来 源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的 cDNA 稀释后等比例混合;(3) 用生物素 标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行 任
ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5) 为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结 合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序 列进行解码和定量测定。采用反转录引ห้องสมุดไป่ตู้将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后 用 焦磷酸测序定量测定标记序列。
(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)
PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)
ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)
dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)
图 1 碱基序列标记法结合焦磷酸测序解码技术测定基因表达量差异的原理图
Fig.1 Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequence tagged reverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同来源的同一基因在单管中只用一对引物进行 PCR，并且 扩增产物的碱基组成和含量完全一样，仅 4 个碱基的排列顺序不一样，具有相同的保留时 间。所以来源不同，表达量不同的同一基因在单管中能实现等比例扩增。SRPP 测定峰高比 值也即能代表起始基因的相对表达量。