金纳米颗粒聚集以及金纳米探针 微阵列技术研究进展

金纳米颗粒聚集以及金纳米探针-微阵列技术研究进展

逄键涛 文思远 王升启#

（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850）

摘 要 金纳米颗粒

（GNP ）探针正引起科学家们越来越多的兴趣。本文主要综述了基于GNP 自组装聚集反应的生物检测和微阵列-金标银染检测的最新进展，对GNP 在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨。引用文献41篇。

关键词 金纳米颗粒，微阵列，生物检测，评述

2005-08-10收稿；2005-12-03接受

本文系国家863资助项目（No.2004BA519A46）

1 引 言

金纳米颗粒（GNP ）是直径为0.8～250nm ［1］的缔合胶体，具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子

隧道效应。按粒子尺寸和聚集情况，GNP 可显示不同的颜色，已被广泛用于光学、电学、电子显微镜检

测的生物分子标记［2］。单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式，使胶体Au 溶液表现出不同的整体

特征。生物分子可参与到GNP 的聚集和组装过程中，

从而干扰GNP 的原始组装方式。通过胶体Au 溶液最终的物理状态（如颜色、吸光度等）可得到参与组装的生物分子的“质、量”特征，达到检测的目的。另外，GNP 逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装技术，芯片诊断、纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。本文着重就GNP 自组装以及GNP 探针-微阵列技术进展作一综述。

2 生物分子辅助的GNP 聚集和组装

2.1 DNA-GNP 探针

灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。基于GNP 聚集反应的分子诊断方法能满足这些要求。Mirkin 发现DNA 特异杂交可使DNA-Au 颗粒自组装为复合结构，开创了GNP 用

于生物检测的新领域［3］。GNP 经巯基修饰的短链DNA 修饰成为编码探针［4］，溶液中加入目标互补

DNA 后，纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应［5］。聚集后溶液颜色发生红7桃红7紫色变化，几小时出

现桃灰色沉淀（DNA-胶体金沉淀）。该现象是DNA 介导的胶体-胶体键合，其过程是可逆的。系统在没有优化的情况下能检测10fmol 的寡核苷酸。

DNA 修饰的GNP 以非交联结构聚集，对于颗粒表面结合的杂交体末端错配有很好的选择性［6］，可

对单核苷酸多态性（SNP ）进行检测。5个人瘤细胞系的基因组DNA 的检测结果与传统方法（质谱、直接测序）一致。这种方法不需要复杂的设备，为SNP 医护现场诊断、个性化医疗提供了可能。Storhoff 等［7］研究了GNP 距离和光学性质的关系，开发出“杂交-读出”的比色检测方法，鉴别核酸序列。DNA 修饰的金纳米探针识别核酸目标分子后发生颜色变化，可检测到zmol （10-21mol ）级的核酸，不需要目

标分子的扩增或信号放大。Sönnichsen 等［8］采用等离子体耦合对金银纳米颗粒间距进行测量，研究了

金银纳米颗粒二聚体的实时组装以及单个DNA 分子杂交的动力学。

“等离子体标尺”可连续监控分子间距离上限达到70nm ，时间超过50min 。

2.2 非标记DNA 检测

双链DNA （dsDNA ）比单链DNA （ssDNA ）表面负电荷堆积程度高，并且dsDNA 的双螺旋结构使氮（N ）、硫（S ）等对GNP 亲和性高的原子包埋更深，所以ssDNA 和dsDNA 对GNP 有不同吸附力。

Li 等［9，10］据此设计了基于Au 颗粒聚集反应的核酸杂交比色检测方法。ssDNA 可吸附负电荷纳米金颗第34卷

2006年6月 分析化学（FENXI HUAXUE ） 评述与进展

Chinese Journal of Analytical Chemistry 第6期

884～888

粒，其结合速率与序列长度和温度有关。GNP 吸附ssDNA 之后处于稳定状态，不会发生盐离子引起的聚集反应。纳米颗粒对核酸的吸附为静电作用，不需要对Au 颗粒、探针或靶序列进行共价修饰。目标

分子和探针的结合是在溶液中进行的，其杂交时间少于1min ，

整个检测只需5min ，不需借助仪器可检测到小于100fmol （10-15mol ）靶分子。

2.3 蛋白质检测

标准凝胶免疫测定（SPIA ）是基于GNP 的生物特异性聚合和分光光度技术，用于蛋白质的检测。Dykman ［11］报道了一种新型的SPIA 技术方法：采用微量滴定免疫板和酶联免疫吸附测定（ELISA ）阅读器。以15nm Au 颗粒偶联的蛋白A ，检测IgG ，研究比较了新型SPIA 和普通SPIA 。该方法的原理是生物分子-纳米金溶液的消光光谱在目标分子加入前后的变化，可能与Au 颗粒的聚合作用有关。3 GNP 标记与微阵列检测

随着高并行化、微型化检测需求的增长，荧光DNA 芯片在DNA 诊断学方面受到的关注越来越多。荧光检测已被证明为有效可用并得到很好的开发，但它有一些问题难以解决，比如染料的低稳定性、物理化学环境影响到其发光强度、昂贵的检测设备等。基于GNP 标记和银增强技术的微阵列检测技术，方法简单，成本低，信号灵敏、稳定，不受外部环境的影响，有利于微阵列技术在中小型医院的推广和医

护现场检测［12］。

3.1 GNP 标记微阵列检测原理

GNP 与生物活性分子的交联可得到大量新型的标记探针，如：Au-脂质、Au-Ni-NTA 以及Au-ATP 等［13］。GNP 在固体表面的组装定位和金标银增强技术是纳米颗粒-微阵列检测的理论基础。

Csáki 等［14］采用扫描原子力显微镜研究了纳米金颗粒标记DNA 分子在芯片表面的分布和标记情

况。Peschel ［15］研究了GNP 的自组装过程及结构性质，尺寸及结构依赖物理性质。DNA 具有独特的识

别能力和物理化学稳定性，可作为GNP 的连接分子。DNA 修饰的Au 胶体颗粒（1～40nm ）特异性固定在互补DNA 修饰的固体表面，构建出表面nm 结构。

Au-Ag 染色法是一种灵敏特异的可视化检测技术，源自现代照相技术、组织化学和免疫金技术，经

过近10年来的优化组合，现已得到广泛应用［16］。Ag 在Au 标记位点特异性沉淀，是一种光学或电子显

微镜下的低放大率可视化方法。Festag 等［17］对GNP-微阵列检测技术条件进行了优化，研究了不同的

基底清洁、活化以及封闭方法，并优化了纳米颗粒标记及其他程序。

3.2 XNA （DNA 、RNA ）及SNP 检测

Taton 等［18］最先开发出GNP 用于DNA 阵列分析的简单方法，包括寡核苷酸修饰GNP 探针和平板

扫描仪。GNP 标记的寡核苷酸目标分子在固体表面的熔解温度发生改变。寡核苷酸互补序列与单核苷酸错配序列熔解温度的差异，可用于二者的鉴别，选择性是荧光标记方法的3倍。Ag 增强信号放大

方法可提高扫描色度阵列检测系统的灵敏度，超出荧光系统2个数量级。Alexandre 等［19］提出了一种

新型的比色检测方法，使微阵列技术可能成为用于科研和临床中的高效、低成本检测工具。GNP 通过亲和素结合在生物素化的DNA 上，其结果信号产生于Ag +在GNP 表面的还原沉淀。该比色方法与荧

光检测方法相比较，检出限相当，大约为1amol （10-18mol ）生物素化的目标DNA 。Wei 等［20］采用寡核

苷酸和拉曼活性染料标记的GNP 探针实现了寡核苷酸的多重检测。Ag 沉淀形成的Au-Ag 核壳结构可引发染料标记颗粒的表面增强拉曼散射。方法在未优化条件下的检出限为20fmol ，具有高灵敏度和高特异性的特点。采用拉曼标签作为窄带光谱指纹，据此可随意设计所需探针，增加了方法的多重和多比

率检测能力。Bao 等［21］提出了一个微阵列检测方法，可进行多重SNP 分型，不需目标扩增和去复杂性。

该方法依赖于GNP 探针的高灵敏度，不需要酶的参与。特异性源于寡核苷酸和纳米探针的两步夹心杂交。用非扩增人基因组DNA 样品检测3个血栓症基因的可能基因型，表明这种多重SNP 检测方法重现性良好。该阵列检测方法简单、快速、稳健，适于多重SNP 的医护现场检测。

3.3 微生物诊断

微阵列已逐步成为细菌检测和鉴定的新方法，具有高并行性检测的特征，但检测方法的复杂性和灵588第6期逄键涛等：金纳米颗粒聚集以及金纳米探针-微阵列技术研究进展