苹果酸-乳酸发酵的生物转化(英文版翻译篇)

苹果酸-乳酸发酵的生物转化目录2.1 前言2.2 酿酒过程中乳酸菌的生态发展2.2.1 葡萄酒中的乳酸菌2.2.2 酿酒中的发展2.2.3 微生物的相互作用2.3 葡萄酒乳酸菌的分离鉴定2.3.1 传统方法2.3.2 分子方法2.4 葡萄酒中乳酸菌的相关代谢2.4.1 碳水化合物代谢2.4.2 有机酸代谢2.4.3 酚类化合物代谢2.4.4 苷水解代谢2.4.5 氨基酸代谢2.4.6 蛋白质和肽的破坏2.5 苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒感官特性的贡献2.6 葡萄酒中苹果酸-乳酸发酵的发展新趋势2.6.1 苹果酸-乳酸发酵剂的使用2.6.2 接种/联合接种的时间2.6.3 木桶/微氧技术中的苹果酸-乳酸发酵2.7 乳酸菌引起的葡萄酒腐败2.7.1 葡萄酒相关的感官特性的影响2.7.2 葡萄酒相关卫生质量的影响2.8 乳酸菌生长的管理办法2.9 结论参考文献2.1 前言葡萄酒中苹果酸-乳酸发酵（MLF）是由酶促使L-苹果酸转化为L-乳酸而定义的，是紧随酒精发酵的二次发酵过程，也会同时发酵。

苹果酸转化为乳酸的反应不属于真正的发酵，而是酶反应，由达到对数期阶段的乳酸菌（LAB）进行。

苹果酸-乳酸发酵主要是由酒球菌进行，因为发现该种具有耐低pH(<3.5) ，高酒精浓度（>10%）和高SO含量（50mg/L）的能力。

很多乳酸杆菌，明串珠菌和片2球菌的耐药菌株也能在葡萄酒中生长和对苹果酸-乳酸发酵有作用；特别是当葡萄酒的pH超过3.5。

苹果酸-乳酸发酵的最大好处是在凉的气候下使葡萄酒产生脱羧，有助于风味及香气的复杂性和提高微生物稳定性。

不幸地是，不受控的苹果酸-乳酸发酵也会引起葡萄酒的腐败，导致风味下降，对人体健康有害，本章节对乳酸菌和苹果酸-乳酸发酵在葡萄酒中的重要发展进行了详解2.2 酿酒过程中乳酸菌的生态发展2.2.1 葡萄酒中的乳酸菌葡萄酒酿造是一个复杂的微生物进程，涉及到酵母菌和细菌。

它们先天存在葡萄的皮中，并在酿酒过程中的桶，罐和设备中也有发现。

大量的研究集中在对葡萄酒中乳酸菌的生态描述；对它在葡萄酒酿造过程中参与的反应及分布和在葡萄汁，葡萄酒和发酵过程中的次级代谢已有深入的研究。

来自葡萄，葡萄汁或葡萄酒的乳酸菌属于两个科，三个代表属。

乳酸杆菌属于乳酸杆属，链球菌科属于酒球菌属和片球菌属。

2.2.1.1 乳杆菌乳杆菌属是高度多样化的革兰氏阳性菌，微需氧细菌，细胞不可移动，有长杆，短杆，可呈现成对或成链的不同尺寸单个细胞。

该属的细菌属于兼性厌氧菌，生长需要含有丰富发酵糖的培养基。

就其糖代谢，它们可以分为两组：----严格的异型发酵----兼异型发酵在异型代谢中葡萄糖转化为乳酸和其它化合物，如乙酸，乙醇和二氧化碳。

还有第三种严格的同型乳酸发酵，从未在葡萄酒中发现。

乳杆菌的几个物种已经从葡萄和葡萄酒中广泛的分离出来，包括，短乳杆菌，布氏乳杆菌，干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌，德氏乳杆菌，植氏乳杆菌，赖氏乳杆菌，希氏乳杆菌等。

2.2.1.2 片球菌细胞不可移动，球形；这是唯一可以形成两个平面的乳酸菌，导致成对，四联球菌或团块球形细胞的形成。

这一属细菌属于兼性厌氧菌，生长需要含有丰富的生长因子和发酵糖的培养基。

它们的最佳温度为25℃-30℃，pH值为6。

它们属于同型发酵，意味着所有的葡萄糖被代谢成乳酸和不发酵的戊糖。

从葡萄酒中分离出来的已知的片球菌中仅四种：有害的片球菌，小片球菌，外片球菌，戊糖片球菌，其中戊糖片球菌，小片球菌在培养基中最为常见。

2.2.1.3 酒球菌酒球菌属于革兰氏阳性菌，不能移动的球菌，一般以不同大小的成对或成链存在。

酒球菌属于兼性厌氧嗜酸菌，在pH为4.8，温度在18℃-30℃间生长。

它需要含有丰富西红柿汁和葡萄汁为补充剂的培养基，10%的酒精浓度也不会抑制它的生长。

葡萄糖被发酵成乳酸，二氧化碳，乙酸和乙醇。

有可发酵的碳水化合物时，将苹果酸转变成乳酸和二氧化碳。

葡萄酒细菌属于酒球菌即先前的明串珠菌，是唯一的嗜酸明串珠菌属。

之后，系统发育表明球菌是明串菌株的亚系分离体，最终这个细菌被定义为新的菌属：酒球菌。

2.2.2 酿酒中的发展在葡萄酒中不同微生物的生长有一定的顺序。

在收获阶段，细菌和酵母菌移植于酒厂。

乳酸菌在葡萄表面，葡萄汁中含量非常低，它们的代表种属有：植物乳杆菌，干酪乳杆菌，肠膜明串珠菌，酒球菌。

在发酵初期，它们开始进行繁衍，但数量只限制在104/mL，随着酒精发酵的进行，数量减少到102/mL；数量的减少也解释了它们对酒精和低pH的敏感性。

发酵一段时间后，在苹果酸-乳酸发酵开始阶段，存活的细胞开始繁衍，数量可以达到106-108/mL。

当细菌达到稳定期发酵完成。

酒球菌是乳酸菌的主要菌属，在发酵初期和苹果酸-乳酸发酵阶段都有。

它自然生长，葡萄酒温度升高到20-25℃和低的SO（少于15-20mg/mL）释放会促进2它的生长。

苹果酸-乳酸发酵完成后，被其它细菌取代，如乳杆菌和片球菌。

这些阶段的循环，增加不同细菌间的相互作用，同样还有酵母菌和细菌。

在标准条件下，乳酸菌在葡萄酒贮藏期间保持活力，在长期的贮藏中发现其没有增长的趋势，只是缓慢渐进性的下降。

贮藏六个月后观察到有轻微的减少，从107到105/mL。

即使这些细胞不再繁衍，它们也能代谢一些物质，产生不良化合物影响葡萄酒的质量，特别是由于片球菌和乳杆菌的影响。

葡萄酒的低营养和不良风味使苹果酸-乳酸发酵很难进行。

温度，pH，酒精，和可用的营养物质都影响着细菌的生长和活力。

高温或低温都会抑制苹果酸-SO2乳酸细菌；高浓度的酒精和SO能杀死它们。

通过在葡萄酒中的不同条件或阻止2乳酸细菌繁衍使达到最低数量在减缓苹果酸-乳酸发酵过程中是需要的。

在某些情况下，在红葡萄酒中获得一定数量的细胞降解苹果酸需要几周或几个月，如今，在含有筛选的苹果酸-乳酸菌珠活性的葡萄酒中直接接种浓缩发酵剂进行培养，已成为一种普遍的做法。

2.2.3 微生物的相互作用2.2.3.1 酵母菌-细菌的相互作用乳酸菌和酵母菌之间的相互作用对发酵和最终产品有重要的作用。

在复杂的生态系统中，微生物对同一个物质可能有竞争或协同促进作用，葡萄酒是酵母菌和细菌之间相互作用的产物。

然而，结果存在争议，很多学者保留这些相互作用是抑制的，其他人认为他们是刺激的。

Patynowski等表明酵母菌产生不确定抑制因素（可能是有毒代谢）可能会抑制细菌的生长。

这些结果可能解释了酵母菌和苹果酸-乳酸细菌的对抗，因为酵母，中链脂肪酸和抗菌蛋白/肽。

由在酒精发酵中会产生一些物质，如，酒精，SO2酵母产生的肽性质和质量及分子的释放取决于酿酒的技术和酵母菌属。

相比抑制作用，其它的研究表明这些相互作用对细菌有积极作用，因为酵母菌可能会促进它们的生长和刺激苹果酸-乳酸发酵。

Challinor和 Rose观察到酵母菌和乳杆菌的13种相互关系。

在它们中酵母菌似乎是有活性的微生物，人工合成缺少的物质，如维生素，氨基酸和嘌呤，为乳酸杆菌生长所必需。

Kennes等表明，当植物乳杆菌和酿酒酵母在低酸条件下，在葡萄糖-柠檬酸共同培养条件下，酿酒酵母减少了由乳杆菌产生的乳酸，稳定了pH值，促进了乳杆菌的柠檬酸发酵。

2.2.3.2 细菌-细菌的相互作用乳酸菌能合成具有代谢活性的物质,如过氧化氢,有机酸和细菌素。

一些研究已经进行了细菌素生产；解决葡萄酒乳酸菌的这些问题和发现了两个细菌素：---由短乳杆菌产生的细菌素Brevicin，3000Da的耐热小分子蛋白，在很宽的pH范围内都有活性，能抑制酒球菌，有害片球菌和短乳杆菌。

---由干酪乳杆菌产生的酪蛋白，具有很高的分子量，但不太稳定。

在戊糖片酒球菌和植物乳杆菌中的一个菌株中也发现了抗菌活性，强烈的抑制酒球菌，肠膜明串珠菌和希尔加德氏菌的生长。

这些分子的发现，对葡萄酒的真实环境提供了唯一的说明。

这些可能是很多物种或特定菌株，所以需要进一步研究，更好的了解它们之间的关系。

Fernandez和Manca de (2006)最近研究的酒球菌中蛋白质的种与戊糖片球菌中非蛋白质种在培养基中的相互作用。

对乳酸菌间代谢物的相互作用提供了新的知识。

2.3 葡萄酒乳酸菌的分离鉴定很多在葡萄酒中生长的细菌可以通过传统的微生物技术分离，如将它们移入有利营养物质的培养基中，这需要用生理盐水（0.9%NaCl）梯度稀释葡萄酒样品。

然后将稀释液移入特定培养基中，通常，厌氧性革兰氏阳性细菌，包括乳酸菌，在pH为4.8的MRS琼脂培养基中生长。

添加0.1%的环乙酰胺抑制酵母菌的生长。

平板在30℃培养10到15天。

Wibowo等表明添加番茄汁，葡萄汁，苹果酸或不同的糖到MRS培养基可促进细菌增加。

通常，在MRS培养基中补充10%的番茄汁用于分离和培养乳酸细菌。

为了获得更多的纯菌群，将各个菌落接种到MRS液体培养基中，在30℃下培养，获得的菌体可以用传统或分子生物学方法进行鉴定。

2.3.1 传统方法传统的方法鉴定乳酸菌是基于表型分析：这些方法是研究细胞的形态特征，代谢产物的性质和吸收确定底物的能力。

形态特征可用显微镜来鉴定，根据细胞的形状，可鉴定它属于哪个属；这个检测方法可以再加上革兰氏染色来验证细胞是革兰氏阳性或不是。

在第二阶段，未确定的种在仅含葡萄糖做碳源的培养基中生长，然后对它们的代谢物进行分析：---如果该种是同型发酵，乳酸菌将是唯一产物（片球菌）---发现有气体则为异型发酵，也包括乙醇和乙酸（酒球菌，乳酸杆菌）最近使用API 50 CH(生物梅里埃)方法对细菌分类。

这一试剂盒可以鉴定乳酸杆菌属和相关生物。

这是一个现成的培养基，在研究微生物的APT 50 CH试剂条上显示出49个碳水化合物发酵轮廓（己糖，戊糖和其它）。

细菌悬浮液（由含有生长所需的所以营养物质组成）接种到每个条带的微管中。

为确保厌氧环境，用石蜡密封。

在培养过程中，碳水化合物发酵成酸，引起pH下降，利用指示剂鉴定颜色的变化，黄色表明阳性特征。

结果构成菌株的生化指标，用于对菌鉴定分类。

发酵物形态不能从酒中对乳酸菌分离：细菌在最佳条件下生长，由于环境的影响，不能真实说明葡萄酒中的真正代谢产物。

一般，鉴别力不高，需要二次培养以获得稳定形态。

因此，通过简单的表型实验，可对明确范围内的物种进行鉴定，有时是困难的，再者这一方法耗时耗力。

2.3.2 分子方法随着分子技术的发展为发酵食物和饮料中微生物的分类打开了新的视野。

它们为食物进程中细菌分类和进化提供了优秀的鉴定工具。

2.3.2.1 16S rRNA测序16S rRNA对种的测序作为分子法已被广泛用于细菌亲缘关系的鉴定。

最近也用于未知细菌的鉴定而变得重要。

这个基因是高度保守的，将其放大用于引物和插入网上现有数据库进行结果测序，通过与其它测序中获得的相似性，可以鉴定未知细菌。