实验二 植物组织培养2-愈伤组织的诱导

中国海洋大学实验报告
2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH
课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验
一、实验目的
1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理；
2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程；
3、熟悉超净工作台的使用。

二、实验原理
植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。

超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。

三、实验仪器试剂
1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔
2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水
四、实验步骤：
（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。

（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。

（3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。

（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。

（6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。

（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。

（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。

（9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下20天左右.
（10）实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。

五、实验现象及结果
（1）
刚开始正常生长，从第二节实验课开始直至实验课结束，持续观察中发现组织块
没有生长，且在组织块边缘呈现浅黑色，倾斜培养瓶可以看到有少量稍浑浊的液体，说明组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。

杂菌来源有细菌、真菌及其它微生物。

染菌原因可能是是接种材料(外植体)、培养基、接种器具带菌，或是操作人员接种不规范引起。

我认为在操作过程中由于操作不严谨受污染的可能性更大。

注意事项有：①实验开始时，进行常规无菌操作准备，酒精喷洒双手后用酒精棉擦拭桌面和实验器具；②实验过程中注意不交头接耳，避免口中呼出的空气污染实验材料；
③点燃酒精灯，且不要离的太远；④培养瓶瓶口过火焰等。

（2）
成活率为44.44%。

被污染的培养瓶中有的长满了真菌，所有组织块被深色网状菌丝覆盖，随着时间越来越久颜色愈来愈深；倾斜培养瓶发现液体浑浊染菌；且组织块在之后的培养中并没有生长现象。

没有被污染的培养瓶倾斜可以看到有非常澄清的少许液体，在组织块边缘有仿佛被水浸泡后的白色物质，即生长出来的愈伤组织慢慢变大。

六、思考题
你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？答：无菌操作对植物组织培养视十分重要的。

因为植物组织培养基可以供给植物细胞的生长，同样也可以供给微生物细胞的生长，操作时稍不小心就引起杂菌污染，细菌繁殖能力比植物细胞强，会争夺培养基内的营养使得组织不能正常生长分化，即实验失败。

在具体操作的过程中要注意：
1.实验前熟悉操作流程；
2.在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
3.接种员先洗净双手，换好专用实验服等；
4.上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，然后搽拭工作台面、接种工具，再将镊子和剪
刀从头至尾过火一遍；
5.接种时，接种员双手不能离开工作台，酒精灯不能离太远，不能说话、走动和咳嗽
等；
6.要避免将植物组织损伤，要保持植物组织特别是分生组织的完整；
7.要将次氯酸钠从组织块表面冲洗干净；
8.接种完毕后要清理干净工作台。