实验二 植物组织培养2-愈伤组织的诱导
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
植物组织培养实验报告
摘要：以大豆子叶为外植体，在MS 培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。
实验结果显示第 2 组即 MS+6-BA〔2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第 3 组即 MS+KT〔0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。
关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织1.1 实验材料：大豆子叶1.2 实验试剂与仪器〔1〕试剂： 75%酒精、MS 干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂〔NAA、2，4-D、KT、6-BA〕、无菌水、升汞、 NaOH 溶液〔2〕仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。
1.3 实验方法培养基的配制与灭菌1.3.1.1 配制培养基的准备阶段〔1〕准备 80 个培养试管及封口膜， 2 个小培养皿、 1 个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每一个培养试管、润洗一下。
带晾干后将试管编号 1-80；〔2〕在称量纸上用百分之一天平分别称取 1.5g 琼脂 4 份， 7.5g 蔗糖 4 份，在烧杯里用千分之一天平上称取 1.185g MS 干粉 4 份〔烧杯不要清洗〕；〔3〕剪小圆纸片 40，均分在两个小培养皿小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10，均分在两个大培养皿中。
然后分别用报纸包好。
〔4〕把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。
1.3.1.2 配制培养基〔1〕在装有 MS 干粉的烧杯中按下表参加植物生长调节剂实验所用的所有激素浓度均为 0.5mg/mL编号培养基配置激素的加样量(ml)6-BA N A A K T2,4-D1 23 4 MS+6-BA〔1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)MS+6-BA〔2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)MS+KT〔0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L)MS+KT〔1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L)0.51.00.250.50.250.50.51.0〔2〕用量筒量取250ml 〔稍多〕蒸馏水，取一个不锈钢杯子参加150ml 蒸馏水和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾 2min，再参加混合好的 MS 培养基 1 号和蔗糖，混合沸腾 2min，用剩余的蒸馏水定容至 250ml；〔3〕当温度降到 60℃摆布时，将溶液 pH 调至 5.8，普通加 4 滴 NaOH 溶液即可；〔4〕取编号 1-20 的培养试管，用大量注射器以每瓶 12.5ml 摆布培养基分装在培养试管中，用封口膜封口， 4 支一捆捆扎好。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
植物的组织_实验报告
一、实验目的1. 熟悉植物组织培养的基本原理和操作技术。
2. 掌握无菌操作技术，学会配制培养基。
3. 学习诱导愈伤组织形成的方法，并观察其生长情况。
4. 了解植物细胞的全能性及其在组织培养中的应用。
二、实验原理植物组织培养是利用植物细胞的全能性，将植物的器官、组织或细胞在人工控制的条件下，诱导分化再生为完整植株的过程。
该实验主要包括以下几个步骤：外植体消毒、接种、愈伤组织诱导、再分化、生根、移栽等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小麦幼苗、MS培养基、愈伤诱导培养基、生根培养基、消毒剂（如70%酒精、无菌水等）、消毒工具（如解剖刀、镊子等）。
2. 实验仪器：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、天平、烧杯、三角烧瓶、培养皿等。
四、实验步骤1. 外植体消毒：将小麦幼苗洗净，用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次。
用解剖刀将幼苗切成1-2mm的段，用无菌滤纸吸干水分。
2. 配制培养基：按照实验要求，配制MS培养基、愈伤诱导培养基和生根培养基。
将培养基分装到培养皿中，高压灭菌30分钟。
3. 接种：将消毒好的外植体接种到愈伤诱导培养基中，每皿接种3-5段，每个处理重复3次。
4. 愈伤组织诱导：将接种好的培养皿放入培养箱中，在适宜的温度（25-28℃）和光照条件下培养。
观察愈伤组织形成情况。
5. 再分化：当愈伤组织形成后，将愈伤组织转移到再分化培养基中。
在适宜的条件下培养，观察愈伤组织再分化为芽和根。
6. 生根：当芽和根形成后，将植株转移到生根培养基中。
在适宜的条件下培养，观察植株生根情况。
7. 移栽：当植株生根良好后，将其从培养皿中取出，用无菌水冲洗根部，然后移栽到土壤中。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织形成情况：实验结果表明，小麦幼苗在愈伤诱导培养基中能形成愈伤组织，愈伤组织生长旺盛。
2. 再分化情况：愈伤组织在再分化培养基中能分化出芽和根，再分化效果良好。
3. 生根情况：植株在生根培养基中生根良好，根长且粗壮。
愈伤组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术的基本操作流程。
2. 熟悉愈伤组织的诱导方法及再分化过程。
3. 学习植物激素在愈伤组织形成与再分化中的作用。
4. 了解植物细胞的全能性及组织培养技术在植物育种中的应用。
二、实验原理植物组织培养技术是将植物器官、组织或细胞在人工条件下进行无菌培养，使其在适宜的培养环境中生长、分化，最终形成完整植株的过程。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一个重要阶段，它是由已经分化的细胞脱分化形成的无定形细胞团。
通过诱导愈伤组织，可以进一步分化为根、茎、叶等器官，实现植物繁殖和育种。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段。
2. 试剂：无菌水、无菌滤纸、70%乙醇、5%次氯酸钠、琼脂、蔗糖、硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、生长素、细胞分裂素、琼脂酶、滤纸等。
四、实验步骤1. 材料预处理（1）将水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段分别用70%乙醇消毒30秒，再用5%次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的材料用无菌滤纸吸干水分。
2. 愈伤组织诱导（1）将预处理后的材料切成约1cm×1cm的小块，放入含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度和光照条件下培养。
3. 愈伤组织再分化（1）将愈伤组织转移到含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）在适宜的温度和光照条件下培养，观察愈伤组织分化为根、茎、叶等器官的情况。
4. 数据记录与分析（1）观察并记录愈伤组织的生长情况，包括生长速度、愈伤组织颜色、形态等。
（2）观察并记录愈伤组织再分化为根、茎、叶等器官的情况，包括器官形态、生长速度等。
（3）分析不同植物激素浓度对愈伤组织形成与再分化的影响。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导实验结果表明，水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段在含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中均能诱导出愈伤组织。
植物组织培养实验(2)
（二）实验原理
在一定的条件下，不同器官（根、茎、叶 等）来源的外植体均可以脱分化形成愈伤 组织。
（三）实验材料和用具
实验材料：黄瓜无菌苗 实验药品： MS、 1mg/ml NAA 、 1mg/ml 6-BA、
1mol/L HCl、1mol/L NaOH、蒸馏水、灯 用酒精、70％酒精、无菌水 。 灭菌培养基：MS1 （MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L NAA）
实验用具：
天平、烧杯、玻璃棒、量筒、移液枪、三 角瓶、pH试纸、电炉、高压灭菌锅。
无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、烧杯、 解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 滴管、记号实验步骤
1. 配制以下培养基各100ml ： MS2：MS+2.0mg/LBA+0.1mg/L NAA MS3：MS+2.0mg/LBA+0.5mg/L NAA MS4：MS+2.0mg/LBA+2.0mg/L NAA ① 取200ml烧杯3只，标记，各加入4g MS培养基和
4. 接种 ① 进入无菌室，用70％乙醇擦洗双手和工作台面，点燃酒
精灯。 ② 解开三角瓶的绳子，将三角瓶按使用先后顺序排好。 ③ 再次消毒双手和工作台面，取出无菌滤纸，用无菌水润
湿。 ④ 在火焰边打开三角瓶的封口纸，烧灼瓶口和镊子，待镊
子冷却后取出无菌苗，放置在无菌滤纸上。 ⑤ 剪成5～10mm小段（根部去掉部分根尖，叶片去叶缘后
剪成50mm2左右的小片），每平皿接种3～5段（片）。 每组接种8瓶，根、茎段、茎尖、叶各2瓶。 ⑥ 光照培养箱25℃暗培养。
作业
1. 1周后观察培养体系有无污染，计算每一个平皿 内染菌外植体数和外植体外的菌落数，分析染 菌原因。
实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化一、目的掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；四、仪器设备及用具（一） 仪器设备超净工作台 培养室（二） 用具（每组5人用量）量筒：100ml ×2培养皿：￠9cm ×1三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1枪形镊：×4无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5五、试剂及培养基（一） 试剂75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml)(二) 培养基1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l六、实验步骤1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制（1）、75%酒精：每组配95ml 。
量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可.（2）、2%NaCLO ：每组配100ml.x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数；y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。
3、种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。
每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 yX= (ml)分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
生物培养植物实验报告
一、实验目的1. 了解植物组织培养的基本原理和操作方法；2. 掌握植物组织培养过程中无菌操作的技术；3. 学习植物愈伤组织的诱导和再分化方法；4. 观察植物细胞的全能性表现。
二、实验原理植物组织培养是将植物器官、组织或细胞在人工条件下，利用培养基提供必需的营养物质和生长因子，使其在无菌条件下生长、发育，甚至分化成完整植株的过程。
植物组织培养主要包括愈伤组织诱导和再分化两个阶段。
1. 愈伤组织诱导：将植物组织在适当的培养基上培养，使其脱分化形成无定形细胞团，即愈伤组织。
2. 再分化：将愈伤组织在特定培养基上培养，使其再分化形成具有特定形态和功能的器官，如根、茎、叶等。
三、实验材料与仪器1. 材料：豌豆种子、无菌水、无菌滤纸、无菌剪刀、无菌镊子、MS培养基、蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、HgCl2（或次氯酸钠）。
2. 仪器：培养室、高压灭菌锅、水浴锅、解剖刀、三角烧瓶（100mL）、烧杯、量筒、培养皿、超净工作台、分析天平、长镊子、剪刀、橡皮筋等。
四、实验步骤1. 配制培养基（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2,4-D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。
（2）试验培养基：在MS培养基基础上，添加适量的蔗糖、2,4-D和6-BA。
2. 植物组织消毒将豌豆种子用无菌水冲洗干净，用70%乙醇浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次。
将消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，用无菌剪刀将种子切成小块。
3. 愈伤组织诱导将消毒后的豌豆种子小块接种到愈伤组织诱导培养基上，置于培养室中培养。
4. 再分化将愈伤组织接种到试验培养基上，置于培养室中培养。
5. 观察与记录定期观察愈伤组织的生长情况，记录愈伤组织的形态、颜色、大小等特征。
待愈伤组织分化出根、茎、叶等器官时，观察其生长状况。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导在愈伤组织诱导培养基上，豌豆种子小块逐渐形成愈伤组织，愈伤组织呈白色、无定形，质地较软。
愈伤组织培养
主要教学内容
愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织的继代培养 愈伤组织的形态发生及调控 愈伤组织培养的应用
愈伤组织
一、愈伤组织的诱导与分化
愈伤组织，原是指植物受伤之后于伤口表面形成 的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指外植体的 增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞。
一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织。 由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始。
复习思考题
1、愈伤组织形态发生的影响
？
因子有哪些？如何进行调节？ 2、愈伤组织培养在植物育种 中的应用有哪几方面？
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
地，节省人力、物力，手续简便，易于远 距离运输，而且不受病虫害的侵袭，便于 交流的优点。
（3）提供育种中间材料 通过组织培养可获得不同性质的愈伤组
织，可为原生质分离、融合或遗传转化提 供优质材料。 （4）可诱导和筛选突变体
（5）制造人工种子 为某些濒危和珍贵物种的繁殖，提供一
种高效的手段。
（二）培养基
1．生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控 制芽和根形成的重要条件之一。细胞分裂素/生 长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时， 有利于根的形成。
2．无机营养元素 营养元素的缺失会导致愈伤 组织生长不良，如： 缺铁：细胞分裂停止； 缺氮：细胞过度生长，形成层组织减退。
诱导培养实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和操作技术。
2. 熟悉愈伤组织诱导培养的方法和过程。
3. 学习分析愈伤组织诱导培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，将植物的器官、组织或细胞在人工控制条件下，通过脱分化、再分化等过程，培育成完整的植株或具有经济价值的生物材料。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一种中间产物，是植物细胞脱分化、再分化过程中的一种重要阶段。
三、实验材料与试剂1. 材料：水稻种子、无菌水、无菌滤纸、剪刀、镊子等。
2. 试剂：1/2MS培养基、蔗糖、琼脂、活性炭、氯化钙、2,4-D、NAA、6-BA等。
四、实验方法与步骤1. 种子表面消毒（1）将水稻种子放入无菌水中浸泡30分钟；（2）用无菌滤纸吸干种子表面的水分；（3）将种子放入含有1%氯化钙溶液中浸泡10分钟；（4）用无菌水冲洗3次，每次1分钟；（5）将种子放入含有70%乙醇的溶液中浸泡30秒；（6）用无菌水冲洗3次，每次1分钟；（7）将种子放入含有1%次氯酸钠溶液中浸泡10分钟；（8）用无菌水冲洗5次，每次2分钟。
2. 外植体接种（1）将消毒后的种子放入含有1/2MS培养基的培养皿中；（2）用无菌镊子将种子均匀分布在培养皿底部；（3）用无菌滤纸覆盖种子，保持培养皿内湿润；（4）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
3. 愈伤组织诱导（1）当外植体长出白色愈伤组织时，将愈伤组织转移到含有2,4-D 2 mg/L和NAA 1 mg/L的1/2MS培养基中；（2）将愈伤组织放入培养皿中，保持培养皿内湿润；（3）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
4. 愈伤组织继代培养（1）当愈伤组织生长到一定大小后，将其转移到含有2,4-D 1 mg/L和NAA 0.5 mg/L的1/2MS培养基中；（2）将愈伤组织放入培养皿中，保持培养皿内湿润；（3）将培养皿放入培养箱中，温度设置为25℃，光照时间为12小时/天。
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导一、实验目的；通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。
二、实验原理：根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。
即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。
愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。
三、实验内容实验包括以下3部分内容：实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存实验1-2、MS培养基的配制与灭菌实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。
2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。
本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。
MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。
另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。
3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。
第四章之二愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型
一、定义 callus
在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无 特定结构和功能的薄壁细胞团。 二、愈伤组织的起始条件
创伤+激素
★机械性创伤 ★微生物入侵
★昆虫袭击
三、来源
植物各种器官、组织、细胞均有产生愈 伤组织的潜在可能性
★光照 暗 弱光 ★温度 20-30℃ ★培养基
N源 NH4+/NO3C源 蔗糖
激素 生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L
细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L
二、愈伤组织的形成过程
特点
愈伤组织形成
起始期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱 分化，愈伤组织结构疏松，缺少组 织结构，颜色浅而透明
形成期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改
变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
❖ **诱导期长短因植物种类、外植体的生理状 态和外部因素而异，即使同一种物种不同基 因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。
0.056
80d
0.253 0.227 0.219 0.124
0.063
第四章之二愈伤组织的诱导、 形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型 第一节 愈伤组织的诱导和形成 第三节 愈伤组织的继代及其生长分析 第四节 愈伤组织形态建成 第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础
植物愈伤组织培养
酶活力 增加
细胞的 大小变 化不大
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
诱导期长短
植物种类
外植体生理状 况
ห้องสมุดไป่ตู้
外部因素
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
分裂期：细胞通过一分为二的分裂，不断
增生子细胞
细胞分裂 快
结构疏松
缺少有组 织的结构
颜色浅而 透明
第一节 植物愈伤组织及形成过程
生细胞
愈伤组织
第一节 植物愈伤组织及形成过程
一 植物愈伤组织的形态结构：
由许多异质细胞集合而成的一个无一定形态结构的细胞聚集体。
松脆
有大量的分 生组织中心
内有大量的 细胞间隙
细胞排列无 次序
致密
无大的细胞 间隙
管状细胞组 成维管组织
第一节 植物愈伤组织及形成过程
一 植物愈伤组织的形态结构：
生 液泡细胞所占比例较高
第三节 植物愈伤组织培养条件与定向诱导
一 植物愈伤组织培养条件：
外植体
• 材料的基因型 • 同一种植物的不同器官和组织 • 幼龄外植体
培养基
• 生长调节剂 • 无机营养元素 • 有机成分 • 物理性质
环境条件
• 光照 • 温度
第三节 植物愈伤组织培养条件与定向诱导
二 不同用途愈伤组织的定向诱导：
三 愈伤组织的形态发生方式：
器官
脱
再
发生
分 离体器官、 化
分 化
发 育
型
组织或细
愈伤组织
根、芽等
植株
胞
胚状体
植株
无激素 培养基
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
生物胡萝卜实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和方法。
2. 学习胡萝卜愈伤组织的诱导、继代培养和细胞悬浮培养技术。
3. 了解胡萝卜体细胞胚胎发生培养的过程。
二、实验原理植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，通过人工控制培养条件，使植物细胞或组织在体外发育成完整植株的技术。
胡萝卜愈伤组织诱导、继代培养和细胞悬浮培养是植物组织培养技术中的重要环节。
三、实验材料与仪器材料：- 胡萝卜- MS培养基- 营养液- 消毒剂- 玻璃器皿- 移液器- 高压蒸汽灭菌器- 恒温培养箱四、实验步骤1. 胡萝卜外植体消毒- 将胡萝卜洗净，切成小块，用70%酒精消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次。
- 将消毒后的胡萝卜小块接种于MS培养基中。
2. 愈伤组织诱导- 将接种后的胡萝卜小块放入恒温培养箱中培养，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。
- 观察胡萝卜小块的愈伤组织形成情况。
3. 愈伤组织继代培养- 将形成的愈伤组织转移到新的MS培养基中进行继代培养。
- 继代培养过程中，每隔一段时间更换一次培养基。
4. 细胞悬浮培养- 将继代培养后的愈伤组织切成小块，接种于营养液中。
- 将接种后的细胞悬浮培养于恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。
- 观察细胞悬浮培养过程中细胞生长和繁殖情况。
5. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 将细胞悬浮培养获得的细胞转移到新的培养基中进行胚胎发生培养。
- 观察胚胎发生培养过程中胚胎的形成情况。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导- 在适宜的培养条件下，胡萝卜小块逐渐形成愈伤组织。
2. 愈伤组织继代培养- 经过继代培养，愈伤组织数量增加，体积增大。
3. 细胞悬浮培养- 细胞悬浮培养过程中，细胞生长和繁殖良好，形成了大量悬浮细胞。
4. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 胚胎发生培养过程中，部分细胞形成了胚胎，进一步发育成胡萝卜植株。
六、实验结论1. 通过本实验，成功诱导了胡萝卜愈伤组织。
植物缔组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和操作技术；2. 通过植物组织培养，了解植物细胞的全能性及再分化过程；3. 掌握愈伤组织的诱导、培养及再生方法；4. 培养学生的实验操作能力和科学思维。
二、实验原理植物组织培养是指将植物的器官、组织或细胞在无菌条件下，通过人工配制的培养基进行培养，使其再生出完整植株的过程。
该实验主要涉及以下几个环节：1. 愈伤组织诱导：将植物外植体在诱导培养基上培养，使其脱分化形成愈伤组织；2. 再分化：将愈伤组织转移到分化培养基上，诱导其分化出根、茎、叶等器官；3. 再生：将分化出的器官继续培养，使其再生出完整植株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：拟南芥、玉米、番茄等植物的外植体；2. 仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、培养箱、解剖刀、剪刀、镊子、移液枪、三角烧瓶、培养皿、滤纸等；3. 试剂：MS培养基、活性炭、琼脂、蔗糖、2,4-D、IAA、6-BA等。
四、实验步骤1. 外植体消毒：将植物外植体用75%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次；2. 外植体切割：用解剖刀将外植体切割成约0.5cm³大小的组织块；3. 愈伤组织诱导：将切割好的外植体接种到诱导培养基上，置于培养箱中培养；4. 再分化：待愈伤组织形成后，将其转移到分化培养基上，继续培养；5. 再生：待分化出根、茎、叶等器官后，将其转移到生根培养基上，培养至生根；6. 成株培养：待植株生长至一定高度后，将其移栽至土壤中，进行常规管理。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导：实验中发现，拟南芥、玉米、番茄等植物的外植体在诱导培养基上均能成功诱导出愈伤组织；2. 再分化：在分化培养基上，愈伤组织逐渐分化出根、茎、叶等器官，部分植株已形成完整植株；3. 再生：在生根培养基上，植株生长良好，生根数量适中；4. 成株培养：移栽至土壤中的植株生长旺盛，叶片翠绿，根系发达。
六、实验结论通过本次实验，我们成功掌握了植物组织培养的基本原理和操作技术，了解了植物细胞的全能性及再分化过程。
愈伤组织培养
愈伤组织培养一、外植体的选择愈伤组织培养的第一步是选择适当的外植体。
外植体可以是植物的根、茎、叶、花、果实等任何部分，但必须具有分生能力。
通常，选择新鲜、健康的幼嫩组织作为外植体，因为这些组织分生能力强，容易诱导出愈伤组织。
同时，外植体的选择还必须考虑其遗传背景、生理状态以及是否容易进行消毒等。
二、愈伤组织的诱导外植体在适当的培养基和条件下，能够被诱导形成愈伤组织。
这个过程涉及到细胞的脱分化，即细胞从特定的组织类型转变成未分化的状态。
为了成功诱导出愈伤组织，需要使用含有足够营养物质和植物生长调节物质的特殊培养基。
例如，高浓度的生长素和细胞分裂素可以促进细胞分裂和组织形成。
三、愈伤组织的增殖诱导出的愈伤组织需要在适合的培养基中进一步增殖。
这个过程需要持续监控并调整培养基的成分，以确保愈伤组织能够快速、健康地生长。
同时，还需要控制培养条件，如温度、光照、湿度等，以提供最佳的生长环境。
四、细胞分化的诱导增殖后的愈伤组织可以进行进一步的分化。
这个过程可以通过改变培养基的成分或添加特定的生长调节物质来实现。
例如，某些激素可以诱导愈伤组织分化成特定的组织或器官。
五、遗传稳定性的维持为了保持愈伤组织的遗传稳定性，通常需要进行长期的培养和多代的筛选。
这个过程可以通过定期检查染色体数目和结构来实现，以确保细胞的遗传稳定性。
同时，通过定期进行克隆繁殖，可以进一步维持细胞的遗传稳定性。
六、培养基的选择与优化愈伤组织培养的成功与否，很大程度上取决于培养基的选择和优化。
培养基是愈伤组织获取营养的来源，必须含有细胞生长所需的各类营养物质，如碳源、氮源、维生素、矿物质等。
同时，还需要添加植物生长调节物质，如生长素、细胞分裂素等，以调节细胞的生长和分化。
对于不同的外植体和实验目的，可能需要选择不同的培养基。
例如，MS、N6、B5等都是常用的培养基配方。
此外，培养基的pH值、渗透压等也需要进行适当的调整。
为了优化培养基，通常需要进行一系列的试验和筛选，以找到最适合特定组织或细胞的培养基配方。
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中国海洋大学实验报告
2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH
课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验
一、实验目的
1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理；
2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程；
3、熟悉超净工作台的使用。
二、实验原理
植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。
三、实验仪器试剂
1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔
2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水
四、实验步骤：
（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。
（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。
（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。
（9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下20天左右.
（10）实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。
五、实验现象及结果
（1）
刚开始正常生长，从第二节实验课开始直至实验课结束，持续观察中发现组织块
没有生长，且在组织块边缘呈现浅黑色，倾斜培养瓶可以看到有少量稍浑浊的液体，说明组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。
杂菌来源有细菌、真菌及其它微生物。
染菌原因可能是是接种材料(外植体)、培养基、接种器具带菌，或是操作人员接种不规范引起。
我认为在操作过程中由于操作不严谨受污染的可能性更大。
注意事项有：①实验开始时，进行常规无菌操作准备，酒精喷洒双手后用酒精棉擦拭桌面和实验器具；②实验过程中注意不交头接耳，避免口中呼出的空气污染实验材料；
③点燃酒精灯，且不要离的太远；④培养瓶瓶口过火焰等。
（2）
成活率为44.44%。
被污染的培养瓶中有的长满了真菌，所有组织块被深色网状菌丝覆盖，随着时间越来越久颜色愈来愈深；倾斜培养瓶发现液体浑浊染菌；且组织块在之后的培养中并没有生长现象。
没有被污染的培养瓶倾斜可以看到有非常澄清的少许液体，在组织块边缘有仿佛被水浸泡后的白色物质，即生长出来的愈伤组织慢慢变大。
六、思考题
你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？答：无菌操作对植物组织培养视十分重要的。
因为植物组织培养基可以供给植物细胞的生长，同样也可以供给微生物细胞的生长，操作时稍不小心就引起杂菌污染，细菌繁殖能力比植物细胞强，会争夺培养基内的营养使得组织不能正常生长分化，即实验失败。
在具体操作的过程中要注意：
1.实验前熟悉操作流程；
2.在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
3.接种员先洗净双手，换好专用实验服等；
4.上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，然后搽拭工作台面、接种工具，再将镊子和剪
刀从头至尾过火一遍；
5.接种时，接种员双手不能离开工作台，酒精灯不能离太远，不能说话、走动和咳嗽
等；
6.要避免将植物组织损伤，要保持植物组织特别是分生组织的完整；
7.要将次氯酸钠从组织块表面冲洗干净；
8.接种完毕后要清理干净工作台。