核酸探针

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2. 特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱 基配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染；
⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
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3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用 [α-32P]dNTP取代原来 DNA链 中不带同位素的同种核苷酸，生成的两 条链均被同位素标记。
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增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
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DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(an性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
第五章 核酸探针技术检测 食品微生物
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核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定条 件下按碱基配对原则形成双链的过程。
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
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第一节 核酸探针杂交的基本理论 一、变性与复性
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2. cDNA探针（complementary DNA）
通过逆转录 ↓ 双链cDNA 优点： 不含内含子及高度 重复序列但不易获得 ↓S1核酸酶切平两端 加接头 ↓限制酶 粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆
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3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂
①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。
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注意： ①待测核酸顺序与探针顺序同源性高 的杂交，用水溶液时取68℃，用50% 甲酰胺溶液时取40℃。 ②待测核酸顺序与探针同源性不高时， 以50% 甲酰胺溶液在35—40℃杂交。
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5. 核酸分子的复杂性直接影响复性几率。 6. 非特异性杂交反应：在杂交前将非特异 性位点进行封闭，以减少对探针的非特异 性吸附作用。 常用封闭物： ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA ②高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉
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蛋白杂交
一、蛋白质的免疫印迹（western) 场所：硝酸纤维素膜 待检分子：蛋白 探针：抗体 杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转 印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与 蛋白杂交，检测特定的蛋白。
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二、所用抗体 1、一抗：针对待测分子的抗体 2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性 同位素或生物素
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1. Southern 印迹杂交 主要步骤：
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纯化的待测DNA样品 限制性内切酶酶切后（EDTA， 65℃灭活限制酶） 琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 变性液（碱变性）
凝胶上DNA变性
Tris缓冲液 中和 高盐下
预杂交 杂交 放射自显影 结果分析
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DNA转印至NC膜
烘干、固定
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southern印迹
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②随机引物法（random priming）
人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列 顺序的混合物，它们可以随机地互补到 DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow 片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA 链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即 可形成放射性同位素标记的DNA探针，但 探针DNA序列是长短不等的。
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5. 菌落原位杂交（colony situ hybridization） 将细菌从平板转移到NC膜上
裂解细菌释出DNA
烘干 杂交
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四、核酸杂交的应用 在医学研究与实践中，核酸杂交主要用 于基因诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血 的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速 鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型 及亲子鉴定
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DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
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解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
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1. 常用的变性方法： ① 热变性
② 酸碱变性
③ 化学试剂变性
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2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA) 识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ Tm值的估算 ① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% ③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）
吸水纸 滤纸 载体
凝胶 缓冲液
固定到载体
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2. Northern印迹杂交 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到 NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质 印迹技术则被称为Western blotting。
3. 斑点杂交（dot blot ）(线状圆形)
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4.原位杂交（in situ hybridization） 直接用探针与细胞或组织切片中的 核酸杂交。 应用：1）观察基因在组织中的表达 2）确定基因在染色体中的定位
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第二节 核酸探针
一、探针的选择原则 1. 高度的特异性 2. 制备探针的难易性和检测手段的灵敏法 二、探针的种类
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1.体连接（质粒、噬菌体）
↓
克隆(PCR扩增)
↓
酶切 优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解 （与RNA比较）；③标记方法成熟。
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二、固体支持物种类
硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、 微孔板等。 选择原则：
① 具有较强的结合核酸的能力； ② 与核酸的结合比较稳定 ③ 尽量少的非特异性吸附
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三、常用固相杂交类型
Southern印迹杂交、Northern印迹杂、 菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、 组织原位杂交、夹心杂交等。
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（二）常用的非放射性标记
优点：无环境污染，可较长时间贮存 方法：1.酶标记法 2.化学标记法 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异 亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响 甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛 （digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、 补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）
优点：比活度高，结果稳定
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③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端
5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ 碱性磷酸酶(AKP） 5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ [γ-32P]ATP T4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）
5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ
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④Klenow片段快速标记DNA探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链 N— 5ˊ→3ˊ外切酶 小片段(36000)
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4. 寡核苷酸探针 优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长 度只有10—50bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂 交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。
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三、探针设计原则：
①长度：10~50bp ②碱基成分:G+C含量为40%~60% ③探针分子内无互补序列。 ④避免同一碱基重复出现。 ⑤ 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因 序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应 超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。
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四、探针标记物的选择 理想的标记物： ①具有高度的灵敏性 ②与探针结合后，不影响杂交及探针的主 要理化特性 ③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率 低，环境污染少，价格低廉；
④若用酶促方法标记，应对Km影响不大
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（一）常用的放射性标记物
1. 常用探记探针的同位素：
32P、3H、35S、14C、125I、131I
3ˊ→5ˊ外切酶 5ˊ→3ˊ聚合酶
—C
Klenow片段（67000）
5′—GAATTC—3′ 3′—CTTAAG—5′
EcoRⅠ 5′——G 3′——CTTAA AATTC——3′ G——5′ Klenow, dNTP,[α-32P]dATP 5ˊ——GAATT 3ˊ——CTTAA AATTC——3ˊ TTAAG——5
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三、操作过程
蛋白的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离不 同的蛋白质
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蛋白印迹
载体
+阳极
-阴极
多孔垫片 滤纸 凝胶
封闭
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杂交（一抗与特定蛋 白结合）
漂洗去除多余的 一抗
二抗与一抗结 合
结果检测
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核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由
于具有互补序列，在一起复性时，互补 序列配对，形成杂化分子。
+ +
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二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜
3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑
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4. 杂交液中的甲酰胺
甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能 降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点：