植物组织培养实验报告

植物组织培养实验报告

摘要：以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。实验结果显示第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。

关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织

1.材料与方法

1.1实验材料：大豆子叶

1.2实验试剂与仪器

（1）试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂（NAA、2，4-D、KT、6-BA）、无菌水、升汞、NaOH溶液

（2）仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。

1.3实验方法

1.3.1培养基的配制与灭菌

1.3.1.1 配制培养基的准备阶段

（1）准备80个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下。带晾干后将试管编号1-80；（2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份（烧杯不要清洗）；

（3）剪小圆纸片40张，均分在两个小培养皿中大小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10张，均分在两个大培养皿中。然后分别用报纸包好。

（4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。

1.3.1.2 配制培养基

（1）在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂

实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL

编号培养基配置激素的加样量(ml)

6-BA NAA KT 2,4-D

1 MS+6-BA

（1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)

0.5 0.25

2 MS+6-BA

（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)

1.0 0.5

3 MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 0.25 0.5

4 MS+KT（1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L) 0.

5 1.0

（2）用量筒量取250ml（稍多）蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水

和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml；

（3）当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；

（4）取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。

（5）用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。

1.3.1.3高压湿热灭菌

（1）将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌锅中用二次排气法在121℃灭菌20min。

（2）高压灭菌锅操作

先关闭高压灭菌锅放气阀, 待锅内压强升到0.05MPa时, 打开放气阀排出空气, 当压力表指针为0MPa时关闭放气阀。继续加热, 当压力表再次升到0.05MPa 时, 再一次排除灭菌锅内的空气, 使压力表指针再次降为0MPa，关闭放气阀。继续加热,让锅内的压力上升到一个大气压（0.103MPa），此时锅内温度为121.6℃时，控制热源，维持压力。20min后，灭菌结束，待高压锅内压力表指针恢复到零后，开启压力锅。

1.3.2接种

1.3.

2.1实验前准备工作

（1）取50粒左右大豆子叶，分成单瓣，在洗衣粉水中仔细清洗，再用流水冲洗，备用；

（2）接种前，用甲醛+高锰酸钾熏蒸接种室和培养室（或用臭氧发生器处理），将培养基及接种工具放入超净工作台台面，打开鼓风机，打开紫外灯；

（3）洗净双手，用75%酒精擦拭双手，并用75%的酒精擦拭超净工作台台面和有关工具，同时喷洒接种室。

1.3.

2.2外植体的灭菌

在超净工作台上进行后续工作。将洗好的大豆子叶在75%的酒精中浸泡8s，把酒精倒出，迅速加入无菌水漂洗两次，再放入升汞中浸泡2min，并用镊子不断搅拌，倒掉氯化汞，用无菌水漂洗7次，漂洗时，后几次无菌水要在大豆子叶中稍许停留。最后转移到大培养皿中备用。大培养皿放入少许无菌水，浸湿大豆子叶。

1.3.

2.3外植体的切割

（1）在火焰旁打开包接种工具的报纸，将接种工具在95%酒精中浸泡，然后用酒精灯灼烧，手不能接触接种器械的前半部分，用火灼烧镊子或手术刀要冷却后方可用于外植体的接种，防止烫伤材料，两把镊子可轮换使用；

（2）待接种工具冷却后，用手术刀对大豆子叶进行切割，切割时，一次取4粒大豆子叶放入小培养皿中，同方向切割完毕后选装方向，将四个方向都切下后，再在中间补一刀，不要切穿。

1.3.

2.4 外植体的接种

在火焰旁打开试管封口膜，使试管口在火焰上过一下，然后把切好的子叶放入培养基上，操作管呈倾斜状态，防止菌从口掉入，将管口再次在火焰上过一下，扎上封口膜。待所有培养试管接种完后，4个一组捆扎，放置在培养架上。

1.3.3观察

（1）在25℃，黑暗下培养一周并观察。

（2）一周后，设置为25℃，光照，继续培养一周，并观察。

2.实验结果

（1）一周后，观察培养试管中大豆子叶生情况，发现部分试管培养基呈绿色，说明该部分试管被污染；有些试管的外植体并未生长，有可能是被烫伤，也可能是生长较缓慢；少部分试管有愈伤组织出现。大概统计了一下培养试管总污染个数未12个，污染率15%。

（2）两周后，进行分组观察，结果统计如下表：

3.分析与讨论

3.1结果分析

从实验结果来看，第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。其余两组的诱导率较低。得出结论，当细胞分裂素6-BA和生长素NAA组合时，6-BA浓度高于NAA浓度对于愈伤组织的诱导率较好；当细胞分裂素KT和生长素2,4-D组合时，KT浓度低于2,4-D浓度对于愈伤组织的诱导率较好。

3.2讨论

3.2.1结果重现性讨论

理论上第1组和第2组中细胞分裂素浓度高于生长素浓度有愈伤和生芽双重作用。第3组和第4组细胞分裂素浓度低于生长素浓度有愈伤和生根双重作用。第1组为前任推荐的对照的培养基，但由于死亡率较高，所以对照性较差。因此