抗肿瘤转移机制的实验方法学研究进展

抗肿瘤转移机制的实验方法学研究进展

肿瘤转移是是恶性肿瘤的一个重要表现，是指肿瘤细胞从原发部位侵入血管、淋巴管或体腔，在新的部位由于血管生成而继续生长，从而形成与原发瘤相同类型肿瘤的过程。主要经淋巴管、血道转移，它的出现往往标志着预后不良，大多数的癌症患者死亡与肿瘤转移密切相关[1]。肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程，大体归纳如下：即机体内原发部位的肿瘤细胞在生长过程中细胞内部的骨架发生重排、变形，从而脱落侵入细胞外基质（ECM），酶解ECM进入循环系统，在循环系统释放的血管生成因子与内皮细胞特异性受体结合后，生成新的血管，瘤细胞在血管构建的“骨架”上增殖，形成一个新的癌巢，再脱离出循环系统，在机体某个点定居下来，并逐渐增殖成长为一个新的肿瘤瘤块的一系列过程。如果肿瘤细胞反复转移，后果则相当的严重。这是目前肿瘤难治的一个主要原因，所以研究抗肿瘤药物抗肿瘤转移的机制，从而筛选、开发出新的能促进机体抗肿瘤转移的药物是非常重要的。

抗肿瘤转移机制的药理实验方法主要涉及到以下几个方面：

1. 建立肿瘤转移的动物模型

一般以大鼠、裸鼠为常用动物模型。将目标瘤细胞如SGC-7901胃癌细胞株、S180肝癌细胞株等置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，培养箱条件为37℃，5%CO2进行细胞培养，0.1%胰酶消化传代后制备细胞悬液，之后将细胞悬液以皮下注射或腹腔注射的方式，将肿瘤移植入动物体内。黄挺[2]等人采用皮下接种W256癌肉瘤的方法建立了Wistar大鼠的肝癌转移模型；魏锦来[3]通过腋下接种SGC-7901细胞悬液的方式建立了裸鼠的胃癌原位移植瘤动物模型。此外还有尾静脉注射、裸鼠脑部右尾状核注射人肿瘤组织制备的细胞悬液等方式接种。现阶段裸鼠的应用对于肿瘤方面的研究更有意义，因为裸鼠体表无毛，其先天性缺乏T淋巴细胞，免疫功能低于别的实验动物，更容易进行异种肿瘤的移植。而大鼠由于价格相对便宜而应用较为广泛。此外也可用C57BL/6小鼠等动物建立动物模型。均应在无菌条件下进行造模，以免细菌等微生物产生污染。

2. 观察转移情况

肿瘤转移的动物模型建立以后，需对动物进行分组实验研究。一般分为空白对照组、药物组、阳性药对照组等。薛晓红等人在进行乳宁冲剂及其拆方对裸鼠

移植瘤肺转移的抑制作用及机制时[4]，将裸鼠分为6组，每组8只，7周后处死裸鼠，取出原发部位肿瘤和肺，分别称重、检测原发部位肿瘤体积和肺部肿瘤转移情况。观察转移情况的方法是：将组织块固定于含有甲醛的固定液中24小时，电子显微镜观察组织表面灰白色结节的数目，即可求出各组平均转移数和转移抑制率。肿瘤转移的好发部位通常是淋巴结、肺部、肝脏甚至脑部，通常需要重点观察这些部位，另外由于肿瘤转移会通过血管，因此还需检查血液的转移情况。一般要在动物建立肿瘤模型的7-10周后才可处死动物观察转移情况，时间过短可能还不能发生转移，时间过长则可能导致动物的死亡。

3. MMP、VEGF的检测

MMP是一种参与肿瘤转移的内源性蛋白酶，其全名是基质金属蛋白酶(matrix metallop roteinases,MMP)，主要分为MMP-2、MMP-9等成分。人体的成纤维细胞、巨噬细胞甚至一部分肿瘤细胞都会分泌出这种酶，其在纤溶酶等外源性酶的作用下，被激活从而酶解细胞外基质（ECM）,使肿瘤细胞越过由ECM构成的天然屏障，进入循环系统，MMP的含量增加能导致肿瘤转移的侵袭性更强。[5]此外它还会与血管生成因子（VEGF）结合诱导血管的生成，VEGF是由肿瘤细胞或巨噬细胞分泌的，其能促进内皮细胞分裂、毛细血管出芽、促进蛋白酶的生成、刺激内皮细胞游走，最终导致新生毛细血管的生成。[6]血管生成构成了肿瘤形成的物质基础，为肿瘤转移提供了优厚的条件。[7]研究抗肿瘤药物是否能抑制MMP、VEGF的表达，从而发挥抗肿瘤转移作用。一般采用免疫组化法（SP-ABC）检测蛋白表达水平。鲁荤[8]等人所采用的SP方法是：将对数生长期的细胞接种于6孔培养板,分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的药物后培养一段时间,再用PBS洗涤、乙醇固定；之后使用抗蛋白抗体进行SP染色；最后在显微镜下计算阳性细胞和阴性细胞的数目，比较出阳性染色和阴性染色。魏锦来采用免疫组织化学-SABC法检测MMP-9、VEGF的蛋白表达水平，通过Western 印迹法检测蛋白质含量，发现药物组的瘤块MMP-9、VEGF的表达水平较低，蛋白质含量下降，即药物下调了MMP-9、VEGF的表达，有一定的抗肿瘤转移作用。Arresten 一种新近发现的强效血管生成抑制因子, 其抑制血管生成的作用显著强于内皮素，很有希望被研制成新一代的抗肿瘤血管生成抑制剂。龙淼云等人9]通过在结肠癌细胞LoVo中导入arresten 基因, 并将其接种至裸鼠, 建立结肠癌肝转移模

型, 观察arresten 对肿瘤转移的作用。研究发现导入arresten 基因的LoVo 细胞形成的转移瘤的微血管密度（MVD）与肿瘤重量均显著低于未转染arresten 基因的LoVo细胞。且转移瘤内的结节数和肿瘤细胞的转移率明显低于未导入arresten 基因的LoVo。提示arresten 可能通过抑制肿瘤血管的生成进而抑制转移肿瘤的生长。

4.血清、腹水、转移瘤内癌胚抗原（CEA）的含量测定

癌胚抗原（CEA）是一种存在于胚胎和大部分原发和转移性结肠癌、乳腺癌等瘤组织中特异性表达的糖蛋白，具有粘附作用，可能对细胞的分化和肿瘤转移有促进作用。其在肿瘤患者的血液中大量存在，更有利于肿瘤的转移。CEA表达的高低可以作为癌症是否转移的一个重要指标[10]。孙华君[11]等人在建立了裸鼠肝转移瘤模型4周后处死裸鼠，采用双抗体放射免疫分析法检测裸鼠血清、腹水、转移瘤内CEA的含量。研究得知三氧化二砷药物组CEA含量明显低于对照组，而三氧化二砷是已用于临床的抗癌药物。由于其作用，使机体内癌胚抗原表达降低，抑制了肿瘤的转移。

5. 微血管密度(MVD)和MLD(微淋巴管密度)的测定

抗血管生成是目前研究抗肿瘤转移机制的最主要的一个部分。研究表明, 实体肿瘤生长至1mm3 以上时即需要新生血管形成,如果不能超过这个体积，肿瘤细胞就会停止生长, 处于休眠状态。肿瘤细胞不发生转移需要达到以下条件：瘤体维持在2～3 mm3, 细胞数在1×107个以内; 且肿瘤在原位保持不变的时间长达数月或数年 [12,13]。在没有新生血管生成的条件下，肿瘤侵袭转移的血行通道不存在, 肿瘤细胞就无法通过血道转移。血管生成为肿瘤转移到新的靶点，生成新的癌巢提供了必要的条件，因此检测瘤组织中微血管密度（MVD）和微淋巴管密度（MLD）的水平，是研究抗肿瘤转移机制的重要指标之一。方法：取淋巴部位的组织、血液、肿瘤组织进行切片后，先用低倍镜找到微血管和淋巴管的密集区，再调到200倍视野进行计数，计数3个视野再求平均值即分别求得。赵士彭[14]等人在研究塞来昔布对人结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制时所采用的MVD计数的方法类似于前者，但在高倍镜下“热点”处观察棕色的单个细胞和细胞丛,以此作为1个血管，是以5个高倍视野(400倍)血管的均数表示平均微血管密度(MVD)的。抗肿瘤药物能下调MVD和MLD的水平，有助于肿瘤转移的抑制。