分离线粒体
差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
分离线粒体蛋白和胞质蛋白
线粒体分离试剂盒说明PMSF一定要在线粒体分离试剂或线粒体裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF 在水溶液中很快失效。
分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。
1 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。
第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。
配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。
如果最终目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞，离心收集细胞。
3 洗涤细胞：用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g，4℃离心5分钟沉淀细胞。
弃上清。
4 预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。
5.匀浆：把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30下左右。
6 匀浆效果的鉴定：不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
通常可以在匀浆10次后取约2微升细胞匀浆，加入30-50 微升台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性( 蓝色) 细胞的比例。
如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆。
随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。
当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。
请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。
同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。
7.把细胞匀浆在600g，4℃离心10分钟。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA（mtDNA）是细胞内的一种特殊DNA，主要存在于细胞的线粒体中。
它是由母亲遗传给子代的，与细胞核DNA有着不同的特征和功能。
线粒体DNA在细胞的能量产生过程中起到关键作用，因此对其进行研究对于理解细胞功能和疾病的发生具有重要意义。
为了研究线粒体DNA，需要将其从细胞中分离出来。
而线粒体DNA分离试剂盒就是为了这个目的而设计的。
它包含了借助化学试剂和特殊操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来的各种试剂和工具。
线粒体DNA分离试剂盒的原理主要可以分为以下几个步骤：第一步：细胞裂解细胞裂解是线粒体DNA分离过程中的第一步。
通过加入裂解缓冲液和蛋白酶，使细胞膜和细胞核膜失去完整性，从而释放出细胞内的线粒体和线粒体DNA。
第二步：线粒体分离在细胞裂解后，线粒体需要从细胞中分离出来。
这一步通常需要使用离心过程，通过调节不同离心速度和时间来沉淀线粒体，从而与其他细胞器分离。
第三步：DNA提取在成功分离出纯净的线粒体后，就需要进行DNA提取。
通过加入相应的试剂和离心操作，将线粒体DNA从线粒体中提取出来。
这一步需要注意避免DNA的降解和污染。
第四步：DNA纯化提取出的线粒体DNA可能还含有其他杂质，需要进行纯化操作。
通过加入适当的试剂和离心操作，将线粒体DNA纯化成较纯的形式，以便后续的实验操作。
线粒体DNA分离试剂盒的原理就是通过上述步骤将线粒体DNA 从细胞中提取出来，并经过分离、提取和纯化等操作得到纯净的线粒体DNA样品，以供进一步的实验研究。
线粒体DNA在人类疾病的研究中具有重要的应用价值。
许多遗传性疾病和退行性疾病都与线粒体DNA的突变和功能异常有关，因此通过研究线粒体DNA可以更好地理解这些疾病的发生机制，并为临床诊断和治疗提供新的思路和方法。
总的来说，线粒体DNA分离试剂盒的原理是通过一系列化学试剂和操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来并进行纯化，为线粒体DNA的研究提供了重要的技术支持和工具。
叶肉细胞的叶绿体和线粒体分离方法
叶肉细胞中的叶绿体和线粒体的分离通常依赖于差速离心技术，这是一种利用离心力通过不同密度和大小分离细胞器的方法。
叶绿体和线粒体可以通过粗破碎细胞获得粗提取液，然后通过离心分离纯化。
下面是一个标准的分离流程：1. 组织匀浆：收集新鲜的植物叶片，并在预冷的匀浆缓冲液中匀浆。
这个缓冲液通常包含适合的缓冲剂（如MOPS或HEPES），渗透压调节剂（如蔗糖或甘露醇），以及保护剂（如EDTA）来保护细胞器免受损坏。
匀浆过程应该足够温和，以避免损坏叶绿体和线粒体，但又足够强以破坏细胞以释放细胞器。
2. 过滤和初步离心：将匀浆液通过细目筛或纱布过滤以去除较大的细胞碎片和未破碎的细胞。
首先使用低速离心（例如1000 g左右，5-10分钟）去除细胞碎片和核。
3. 差速离心：收集上述低速离心后的上清液，然后在更高的速度下离心（例如5000-15000 g，10-20分钟），以沉淀叶绿体。
收集叶绿体沉淀，将上清液进行更高速度的离心（例如20000-50000 g，30分钟以上）以沉淀线粒体。
4. 洗涤和纯化：可以用同样的缓冲液轻轻重悬叶绿体和线粒体沉淀，并再次离心以清洗并进一步纯化。
可以重复上述离心步骤，或者使用密度梯度离心来进一步纯化叶绿体和线粒体。
5. 密度梯度离心（如果需要更高纯度的细胞器）：梯度通常使用蔗糖、过氧化氢或聚乙二醇等物质制备。
把叶绿体和线粒体悬浮液层叠在密度梯度上，然后进行高速离心，不同密度的细胞器会在梯度中不同的位置聚集。
6. 收集和存储：在密度梯度离心后，仔细收集不同密度的带，其中包含纯化的叶绿体和线粒体。
采集后的细胞器可在适当的缓冲液中存储于低温条件下，以保持其功能。
在整个过程中，细胞器的完整性和功能的保持是非常重要的，因此所有步骤都应在低温、缓冲的条件下轻柔地操作。
另外，根据研究目的，可能还需要添加特定的酶抑制剂或其他添加剂以保护细胞器免受损伤。
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，进而提取其中的DNA。
线粒体DNA是细胞中的一个重要组成部分，它负责细胞能量代谢的调控，对细胞的正常功能发挥起着至关重要的作用。
分离线粒体DNA对于研究细胞的功能及疾病的发生机制具有重要意义。
线粒体DNA分离试剂盒原理主要包括以下几个步骤：细胞溶解。
在进行线粒体DNA的分离之前，首先需要将细胞溶解，使得线粒体能够从细胞内部被释放出来。
通常使用含有细胞膜破裂酶的缓冲液进行细胞溶解，破坏细胞膜结构，释放出细胞内的线粒体。
线粒体富集。
在细胞溶解后，线粒体和其他细胞器混合在一起，需要通过质量差异将线粒体富集起来。
这一步可以利用超速离心对细胞提取物进行离心分离，线粒体在特定离心速度下沉降速度比较快，因此可以富集到下沉的沉淀物中。
然后，DNA提取。
在线粒体获得富集后，接下来需要进行DNA的提取。
通过添加蛋白酶、盐溶液等进行线粒体膜的破裂，释放出线粒体内的DNA。
然后使用乙醇沉淀法或硅胶柱法将DNA分离出来，并通过离心将DNA沉淀下来。
纯化和检测。
分离出的线粒体DNA往往还会存在一定程度的杂质，需要进行纯化处理。
通过特定的柱式层析或凝胶电泳等方法进行DNA 的纯化，去除掉余留的蛋白质、RNA等杂质。
通过比色法或荧光定量等方法检测DNA的浓度和纯度，以确保获得的线粒体DNA能够用于后续的实验研究或分析。
线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，提取其中的DNA，并进行纯化和检测，为后续的研究工作提供可靠的实验材料。
通过这一技术手段，研究人员可以更加深入地了解细胞内线粒体的功能及其在疾病发生中的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的理论依据。
【2000字】第二篇示例：线粒体DNA（mitochondrial DNA，简称mtDNA）是线粒体内含有的一种特殊的DNA，其具有独特的特性和功能。
线粒体的分离与鉴定
三、实验用品
1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材
冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、200 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。
3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ⑤ ⑦ 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)
一、实验目的
初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的
能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。
七、作
业
线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细 胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高 活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中 需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项 及改进方法。
分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层 有什么作用?
心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
细胞线粒体分离试剂盒
细胞线粒体分离试剂盒简介：Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。
不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
2、立即取匀浆液，加入等量Wash buffer ，轻轻颠倒混匀数次。
3、4℃，1300g 离心5min 以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
4、上清液转移至一干净离心管，4℃ 1000g 离心5min ，重复2次。
5、上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000～15000g 离心15min ，重复1次。
6、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。
随后把收集的上清12000g ，4℃离心10min ，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
注意事项：1、 分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷，全部操作时间尽量控制在1h 以内。
编号 名称CS0201 50T Storage试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml-20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光 试剂(C): Wash buffer100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml-20℃ 使用说明书1份2、通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取1000g和15000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可用2000g和6000g。
细胞线粒体分离试剂盒经验
细胞线粒体分离试剂盒经验
细胞线粒体分离试剂盒是用于分离纯化细胞线粒体的实验试剂盒。
在使用过程中，以下是一些经验：
1. 选择合适的细胞类型和细胞数量：不同细胞类型和数量可能需要不同的试剂浓度和处理时间，因此在开始实验前，需要根据实验目的和细胞类型确定合适的细胞数量。
2. 严格按照使用说明书进行操作：细胞线粒体分离试剂盒通常会提供详细的使用说明书，包括试剂的准备、离心条件、洗涤等步骤。
在操作过程中，要严格按照说明书的步骤进行操作，避免产生误差。
3. 细胞裂解条件的优化：细胞裂解是线粒体分离过程中的关键步骤。
在进行裂解之前，需要优化裂解缓冲液的浓度和温度，以确保细胞裂解充分并保持线粒体的完整性。
4. 离心条件的调整：离心是用于分离细胞线粒体的重要步骤。
在使用过程中，可以根据细胞类型调整离心条件，包括离心速度和离心时间，以获得最佳的线粒体分离效果。
5. 线粒体纯度的验证：在线粒体分离后，可以通过测定线粒体特异性标记物（如线粒体内膜蛋白等）的存在来验证线粒体的纯度。
如果发现其他细胞组分的污染，可以尝试调整试剂盒中的处理步骤，以提高线粒体纯化效果。
总的来说，合理选择细胞类型和数量，严格按照试剂盒的使用
说明进行操作，调整裂解和离心条件，并验证线粒体的纯度，可以获得较好的细胞线粒体分离效果。
实验五线粒体的分离与观察
2023
对分离得到的线粒体进行活性鉴定。
01
掌握用差速离心技术分离制备线粒体的方法。
02
一、实验目的
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。
01
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
02
二、实验原理
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.
1
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。
2
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
3
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
细胞线粒体分离
细胞线粒体分离在进行细胞线粒体分离实验时，确保实验步骤的准确性和实验环境的无菌性是至关重要的。
以下是一个基本的线粒体分离流程，以及一些重要的注意事项。
实验材料：1. 新鲜的组织或细胞样品2. 预冷的线粒体缓冲液（MB）3. 预冷的分离介质（例如Percoll或Nycodenz）4. 离心管和离心机5. 显微镜和细胞计数器实验步骤：1. 收集新鲜的组织或细胞样品，并用预冷的MB缓冲液冲洗以去除任何残留物。
2. 将组织或细胞样品放入离心管中，并加入足够的预冷MB缓冲液以覆盖样品。
3. 用锋利的刀片将组织或细胞样品切成小块，然后使用研磨器将其研磨成匀浆。
4. 将匀浆通过纱布或棉签过滤，以去除大的颗粒和细胞残骸。
5. 将过滤后的匀浆转移到离心管中，并加入足够的预冷分离介质。
6. 以适当的离心速度离心样品，以分离出线粒体。
7. 使用显微镜和细胞计数器对离心后的样品进行观察和计数，以确保获得了足够的线粒体数量。
8. 将分离出的线粒体用于后续的实验或保存以备后用。
注意事项：1. 在整个实验过程中，要确保使用的所有溶液都是预冷的，以避免线粒体的热损伤。
2. 在切割、研磨和过滤组织样品时，要尽量减少对线粒体的机械损伤。
3. 离心速度和时间要根据实验条件进行调整，以确保最佳的线粒体分离效果。
4. 在使用显微镜和细胞计数器进行观察和计数时，要确保样品的代表性，并避免误差的产生。
5. 实验过程中要避免污染，包括对溶液、器具和操作者的污染。
所有使用的器具都应经过消毒处理，并在无菌环境下操作。
6. 线粒体是细胞内的亚细胞结构，其功能与细胞的能量代谢密切相关。
因此，线粒体分离实验的结果可以反映细胞的生理状态，对于研究细胞的能量代谢、疾病机制等方面具有重要的意义。
7. 线粒体分离实验的难度较大，需要操作者具备较高的实验技能和经验。
因此，在进行实验前，应充分了解实验原理、熟悉操作流程，并严格按照实验步骤进行操作。
8. 在实验过程中，应注意安全问题。
分离线粒体
从组织培养细胞中分离线粒体原理：细胞在低渗缓冲液中会膨胀，这是在Dounce匀浆器中用与匀浆器紧密吻合的研杵研磨几下就会破裂。
然后即可在差速离心线分离线粒体。
需注意：溶液、试管、匀浆器都应在冰上预冷。
所有离心步骤要在4°C进行。
所需物品：10ml玻璃离心管，冰冷的PBS，Dounce匀浆器，1.5ml离心管，4°C离心机。
RSB低渗缓冲液:10 mmol/L NaCl2.5 mmol/L MgCl210 mmol/L Tris-Hcl, pH7.52.5X MS缓冲液525 mmol/L甘露醇175 mmol/L蔗糖12.5 mmol/L Tris-Hcl, pH7.52.5 mmol/L EDTA，pH7.51X MS缓冲液210 mmol/L甘露醇70 mmol/L蔗糖5 mmol/L Tris-Hcl, pH7.51 mmol/L EDTA，pH7.5实验步骤：实验开始前，准备足够的RSB缓冲液（1 ml/次）：每毫升RSB、MS缓冲液中加入2μl蛋白酶抑制剂和1μl DTT。
1.用10ml玻璃离心管收集5 x 107个细胞。
2.PBS洗细胞一次，将细胞在4°C 下，600 g x 5 min 离心一次；3.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml冰冷的PBS；4.细胞在4°C 下，600 g x 5 min 离心一次；5.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml 冰冷的RSB缓冲液，冰上孵育10 min；6.将细胞重悬液全部转移到合适的已预冷的Dounce匀浆器中，用研杵上下研磨30～50次左右。
注：可在显微镜下检测匀浆的效果。
取2～3μl匀浆液滴在载玻片上，显微镜下观察，若70～80％的细胞核周围不存在一圈亮环，则说明匀浆效果较好，否则再研磨10次。
7.立刻加入0.8ml 2.5 X MS缓冲液至终浓度为1XMS，用封口膜封住匀浆器顶端，混匀；8.将匀浆液转移到1.5ml离心管中，4°C ，1000 g x10 min 离心一次；9.将上清液转移到另一干净的1.5ml离心管中，4°C ，17，000 g x20 min 离心一次；10.收集上清液（即细胞浆部分），将离心后的细胞沉淀重悬于0.1ml MS缓冲液；11.Bradford法测定蛋白浓度。
医学专题细胞核和线粒体的分离和观察
（二）高速离心分离提取线粒体
▪ 1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯 (shāobēi)中取出，配平后，以17000g离心20分钟，弃上 清，留取沉淀物。
▪ （本实验用12000rpm,非冷冻离心）
▪ 2、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸管吹打成悬液，以
17000g离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉 淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混匀成悬液 (可用牙签)。
第十六页，共二十页。
▪ 3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于 干净(gānjìng)载玻片上(分别标记④、⑤涂片)， 各滴一滴1％詹纳斯绿b染液染20分钟, 盖 片观察。
▪ 4、油镜观察。
第十七页，共二十页。
注意事项
▪ 1、各步骤加入的溶液(róngyè)的量需根据离心管的大小自行 调整。
▪ 2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧 化。
一、实验 目的 (shíyàn)
1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分 离方法 3、对分离得到(dé dào)的细胞核及线粒体进行 活性鉴定。
第二页，共二十页。
二、实验 原理 (shíyàn)
▪ 细胞器分离(fēnlí)基本步骤
细胞(xìbāo)破 碎
分离、纯化
第十九页，共二十页。
内容 总结 (nèiróng)
细胞核与线粒体的分级分离。2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法。从低速到 高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。8、将①、②、 ③涂片(tú piàn)用l％甲苯胺兰（或亚甲基蓝）染色后盖片即可观察。1、各步骤加入的溶液的量 需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。 2、本实验步骤有哪些可以改进的地方
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
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线粒体的分离
实验三线粒体的分离、超活染色与观察一、实验目的1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。
2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
3、学习细胞器的超活染色技术。
二、实验原理利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
三、实验材料与方法1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。
2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
线粒体膜分离 线粒体外膜 内膜的分离
线粒体膜分离线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心１. 配液：(1)10mmol/L PBS pH7.4。
(2)0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL pH7.4。
(3)用10mmol/L Tris-HCL pH7.4配制25.2%、37.7%、51.7%、61.5%(w/v) 的蔗糖液。
２.操作步骤全部操作在冰浴中进行，溶液须预冷。
(1)纯化的线粒体悬浮在10mmol/L PBS、pH7.4中膨胀20分钟，再以105000g离心60分钟，弃上清液，沉淀含内外膜。
沉淀重悬浮于0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL pH7.4中以11500g离心15分钟，上清液用于分离线粒体外膜，沉淀用于分离线粒体内膜。
(2)线粒体外膜的分离:①吸取上述上清液，以105000g离心60分钟，弃上清沉淀重悬于适量的0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL溶液中。
②用带长针头的注射器分别吸取3mL的25.2%、37.7%、51.7%蔗糖溶液，并以叠层铺在超速离心管中，制备不连续的密度梯度。
③吸取2mL样品液小心加在25.2%蔗糖溶液的界面上。
④以165000g离心45分钟，线粒体外膜处在样品液与25.2%蔗糖溶液的交界面上，用注射器收集线粒体外膜。
(3)线粒体内膜分离：①把11500g离心15分钟后的沉淀物重新置于适量的25.2%蔗糖溶液中。
②用注射器吸取2ml的25.2%蔗糖溶液，另外分别吸取2.5mＬ的37.7%、51.7%、61.5%的蔗糖溶液，然后依次叠加超速离心管中，制成不连续的密度梯度。
③吸取1.9mL样品液，加在25.2%蔗糖溶液界面上，以77000g离心90分钟，作第一次分离，在37.7%与51.7%蔗糖溶液界面下为内膜区带。
④吸出内膜区带，加8倍体积蒸馏水并再次匀浆，然后以85000g离心30分钟，弃上清液，沉淀悬浮在0.25mol/L蔗糖溶液中。
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从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法
所需缓冲液：
RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）
10mM NaCl（Mr=58.44）
2.5mM MgCl2（Mr=20
3.3）
10mM Tris-Cl（PH8.0）
调PH值至7.4
配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）
525mM甘露醇（Mr=182.17）
175mM 蔗糖（Mr=342.3）
12.5mM Tris-Cl（PH8.0）
2.5mM EDTA（PH8.0）
调PH值至7.4
配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液
210mM甘露醇
70mM 蔗糖
5mM Tris-Cl（PH8.0）
1mM EDTA（PH8.0）
调PH值至7.4
配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：
溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：
1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
3．细胞一破碎，立刻加入2ml 2.5×MS缓冲液至终浓度为1×MS。
4．750g离心10min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
5．将上清转移至另一离心管中，重沉淀细胞核一次。
6．将上清转移至另一离心管中，10000g离心20min沉淀线粒体。
7．弃上清，用1 ml 1×MS缓冲液重悬沉淀，750g离心10min，取上清，10000g离心20min，弃上清，用适当体积的1×MS缓冲液重悬沉淀。
从组织中分离线粒体
1．取组织，切成小块，用1×MS缓冲液漂洗以除去血液，转移至10ml离心管中，加入5ml 1×MS匀浆缓冲液，再加5×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆。
2．750g离心10min，将上清转移至另一离心管中，重沉淀细胞核两次。
3．收集上清，10000g离心20min以沉淀线粒体。
4．弃上清，用1 ml 1×MS缓冲液重悬沉淀，750g离心10min，取上清，10000g离心20min，弃上清，用适当体积的1×MS缓冲液重悬沉淀。