细胞支原体污染一般情况及预防措施
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
细胞支原体污染怎么办？该怎么处理？
甲：细胞里突然出现小黑点，问君能有几多愁?乙：珍贵的细胞萎靡不振，扔了重买?相顾无言，惟有泪千行。
丙：细胞转染效率极低，实验结果遥遥无期，我的课题前功尽弃!但见泪恨湿，不知心恨谁!细胞培养中，最怕的就是生物污染，支原体污染就是其中的一种。
支原体这种微小的微生物，是细胞培养中令人头疼的大问题。
支原体结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。
支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。
支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。
例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。
无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。
支原体污染在细胞培养中实际上是比较常见的，可达30%甚至更高。
支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。
定期检测支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。
一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。
将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
预防支原体污染的建议：细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞常见污染情况分析报告
细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
支原体感染危害及预防措施
支原体感染危害及预防措施支原体感染是一种常见的细菌感染疾病，可引起多种疾病，包括肺炎、气管支气管炎和生殖道感染等。
具有很高的传染性，容易通过空气飞沫和密切接触传播。
本文将介绍支原体感染的危害及预防措施。
一、支原体感染的危害支原体感染的危害主要体现在以下几个方面：1. 呼吸道感染：支原体感染可引起呼吸道疾病，如肺炎、支气管炎等。
在感染后，患者常常出现咳嗽、咳痰、咽痛等症状，严重时可导致呼吸困难，严重影响日常生活。
2. 生殖道感染：支原体感染还可引起生殖道疾病，如尿道炎、宫颈炎等。
女性患者可能会出现白带异常增多、异味以及阴道瘙痒等症状，严重时可引起盆腔炎症。
3. 眼部感染：支原体感染还可导致结膜炎，患者可能会出现眼红、眼痒、流泪等症状，严重时可影响视力。
4. 关节炎：一些支原体感染还可引起关节炎，患者可能会出现关节红、肿、疼痛等症状，影响关节活动能力。
二、支原体感染的预防措施对于支原体感染，我们可以采取以下措施进行预防：1. 加强个人卫生：保持良好的个人卫生习惯，包括勤洗手、勤换洗衣物、保持室内空气流通等，有助于减少病菌的传播。
2. 避免密切接触：尽量避免与已经感染支原体的人密切接触，特别是在其症状明显时。
避免使用他人的个人物品，并注意避免与呼吸道有感染的人分享餐具和杯子。
3. 良好的饮食习惯：保持良好的饮食习惯，注意均衡饮食，增加对抵抗力的养护。
多食用富含维生素和矿物质的新鲜蔬菜水果，同时远离辛辣刺激性食物，有助于提高免疫力。
4. 健康生活方式：保持良好的生活习惯，适度运动，保证充足的睡眠，提高身体素质和免疫力，降低感染的风险。
5. 定期健康检查：定期进行健康体检，如定期进行妇科、泌尿科等相关检查，早期发现和治疗感染，有助于避免并发症的发展。
总结起来，支原体感染是一种常见的细菌感染疾病，具有较高的传染性。
为了预防该疾病的发生，我们应该加强个人卫生意识，避免与感染者密切接触，保持良好的饮食习惯和生活方式，定期进行健康体检等。
细胞培养污染的途径、危害及预防措施
细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。
由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。
由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。
随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。
此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。
1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。
细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。
每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。
同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。
为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。
具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。
经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。
培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。
随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。
应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。
细胞培养中的支原体污染
生物特性：
无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，其直径仅有 0.13～0.18μm，是目前发现的最小细胞，并且变形能力大，故能通过滤菌 器。 革兰氏染色不易着色或呈阴性。 胞膜中含有胆固醇或其他甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物 理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大。 多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7.6~8.0），对酸耐受性差。
原体是没有作用的。
支原体污染应对策略
新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合 成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞前对抗支原体最理想的 方法。
支原体污染来源
工作环境的污染
操作者本身的污染（包括操作者操作不当以及某些支原 体在人体是正常菌群） 实验器材的污染 培养基等试剂的污染
被污染细胞造成的交叉污染
制备细胞的原始组织或器官的污染
支原体污染的类型
口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans)
梨支原体(M. pirum)
莱氏无胆甾原体(idlawi）
支原体污染有时易被忽视！
1.培养液可不发生混浊
2.细胞病理变化轻微或不显著
3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从 培养器皿脱落
但支原体污染对细胞的影响却是极大的！！！
1、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至 停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、 贴壁细胞脱落、裂解等。
细胞污染
二、细胞污染的预防
消毒（耗 材、制备 间）
无菌操作
消毒
• 制备间 0.1% 新洁尔灭、75%酒精、紫外
照 射、臭氧熏
• 物料耗材 高压灭菌、75%酒精、紫外照
病毒污染
由于病毒有种属特异性， 所以病毒污染的概率比 较小。病毒污染难于发 现，一般的实验室都没 能力检查细胞培养中污 染的病毒。由于病毒一 般潜伏在细胞内，对整 个细胞培养不是致死的， 但它可能会影响实验的 结果。
人角膜上皮细胞被HSV-1感染后的形态学变化
细胞交叉污染
• 细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行， 而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染使培 养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性， 形态发生变化。
支原体污染
支原体无细胞壁形态呈高度 多形性，可为圆形、丝状或 梨形。直径0.2~0.3μm，一 般过滤除菌无法去除它，光 镜下难以看清它的形态结构。 培养细胞受支原体污染后， 多数细胞病理变化轻微，部 分敏感细胞可见细胞生长增 殖变慢，部分细胞变圆，从 瓶壁脱落。
支原体内的DNA被荧光染料着色
原虫污染
培养液可轻微浑浊，显 微镜下那些细小的点状 物数量非常多，轻微活 动，细胞虽然可以 生长 但繁殖速度却明显减慢， 而且细胞状态不好，边 缘不清楚，细胞不透亮。
螨虫污染
黑胶虫污染
• 存在争论
生物：直径小于0.1μm，大多国外血清中多见，可能是国 外牛血清中含有的某种原虫。 非生物：血清中的某些蛋白成分的物质，经过灭活之后丧 失活性，在培养基中，镜检见到的运动其实是这些物质在 溶液中做“布朗运动”。
如何预防细胞培养污染问题
如何预防细胞培养污染问题细胞培养是生物学和医学研究中常用的一种技术方法，但细胞培养过程中常常会面临细胞污染问题。
细胞培养污染会严重影响实验结果的准确性，因此需要采取一系列措施来预防细胞培养污染。
本文将介绍几种常见的细胞培养污染问题以及预防措施。
1. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
来自操作人员、试剂、培养器具和工作环境等多方面的细菌污染都可能导致细胞培养中的细菌污染。
预防措施：•穿戴合适的实验服和手套，并进行消毒处理，减少操作人员带入的细菌污染。
•使用无菌、高质量的试剂，并在实验中进行常规无菌操作，保持培养器具的无菌状态。
•经常对实验室进行清洁和消毒，保持工作环境的无菌。
2. 真菌污染真菌污染是细胞培养中另一个常见的问题。
真菌往往来自环境中的空气、试剂、培养器具或操作人员。
真菌污染会导致细胞生长异常，细胞死亡或实验结果异常。
预防措施：•定期消毒工作环境，特别是操作台和培养箱，避免真菌的滋生。
•使用高质量的培养基和抗生素，抑制真菌的生长。
•采取无菌技术操作，减少操作人员带入的真菌污染。
•定期更换培养器具，特别是培养瓶和培养皿，避免真菌滋生。
3. Mycoplasma 污染Mycoplasma 污染是细胞培养中常见但容易被忽视的问题。
Mycoplasma 是一类细小的细菌样微生物，常常会导致细胞株的污染。
Mycoplasma 污染会影响细胞生长、代谢以及实验结果的可靠性。
预防措施：•定期检测细胞株的 Mycoplasma 污染情况，可以使用 PCR 或流式细胞术等方法进行检测。
•新购买的细胞株进行隔离培养，并进行 Mycoplasma 检测，确保细胞株的无菌性。
•严格控制培养器具、培养基和操作人员的无菌操作，减少Mycoplasma 污染的可能性。
•定期更换培养基并添加抗生素，可以抑制 Mycoplasma 的生长。
4. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，不同细胞株之间发生的细胞混合现象。
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办（2016年10月16日）一、细胞支原体污染的图片我们首先来认识一下，细胞支原体污染与非污染的图片有什么区别。
如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。
而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI 染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。
（版权声明：上图来自上海易色医疗科技有限公司网站。
）二、细胞支原体污染的危害和表现细胞支原体污染的危害（1）培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。
例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献1）。
Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！细胞支原体污染的危害（2）1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！●结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）●参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assayresults due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。
细胞培养污染问题及解决方案
一、细菌污染状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
预防和补救：1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。
3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。
二、霉菌及真菌污染状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。
预防和补救：1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。
2.控制外来人员进出实验室。
3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。
4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。
悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。
贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。
三、支原体感染状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
预防和补救：预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。
补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。
四、黑蛟虫状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。
支原体感染如何避免感染对呼吸系统的影响
支原体感染如何避免感染对呼吸系统的影响支原体感染是一种常见的呼吸道感染，其病原体为支原体，可引起多种呼吸系统疾病，如肺炎、支气管炎和咽炎等。
为了避免感染并减轻对呼吸系统的影响，以下是一些预防和应对支原体感染的措施。
1. 提高个人卫生水平保持良好的个人卫生习惯是预防支原体感染的基本措施之一。
定期洗手，特别是在接触公共场所、外出回家、咳嗽、打喷嚏、使用厕所后，都应该用肥皂和流动水充分洗手。
建议使用一次性纸巾或肘部遮住口鼻，以防止病原体从口鼻进入呼吸道。
2. 避免接触患者和患者分泌物支原体感染具有一定的传染性，可通过空气飞沫、近距离接触和接触患者的分泌物（如鼻涕、咳嗽痰液）传播。
因此，尽量避免与已确诊或疑似感染的患者密切接触，并注意避免接触其分泌物。
在照料感染者时应戴上口罩、手套等防护用具，以减少风险。
3. 加强室内通风支原体感染在封闭空间中易于传播和滋生。
良好的室内通风可以有效降低感染风险。
定期开窗通风，保持室内空气流通，有助于将空气中的病原体稀释和排除。
4. 健康饮食和补充营养保持良好的身体免疫系统是预防支原体感染的重要因素之一。
均衡饮食，摄入富含维生素C、维生素E、锌和其他抗氧化剂的食物，可以增强免疫力，提高机体抵抗力。
建议多吃新鲜蔬菜、水果以及富含蛋白质的食物，避免过度进食高糖、高脂肪食物。
5. 加强体育锻炼和养成良好生活习惯适度的体育锻炼和良好的生活习惯有助于增强免疫力和身体健康。
坚持适度运动，保持良好的睡眠质量和作息规律，避免长时间暴露在寒冷、潮湿的环境中，有助于改善身体素质和提高抵抗力。
6. 接种疫苗目前已有支原体感染的相关疫苗可供接种。
根据年龄和健康状况，接种相应的疫苗可以增加身体对支原体感染的抵抗能力。
在接种疫苗前，最好咨询医生的建议，了解适当的接种时间和剂量。
7. 及时就医和按医嘱治疗如出现呼吸道感染的症状，如发热、咳嗽、喉咙痛等，应及时就医，接受专业医生的诊断和治疗。
同时，按医嘱正确使用抗生素或抗病毒药物，遵循治疗方案，完成疗程，以避免感染加重和并发症的发生。
支原体感染如何预防和治疗皮肤感染
支原体感染如何预防和治疗皮肤感染支原体是一种常见的细菌感染病原体，可引起多种疾病，包括皮肤感染。
本文将介绍支原体感染的预防和治疗方法，帮助读者更好地了解和应对这一健康问题。
一、支原体感染的预防措施1. 保持良好的个人卫生习惯：支原体感染主要通过飞沫传播，因此保持良好的个人卫生习惯是预防感染的关键。
包括经常洗手，特别是在接触脸部、鼻子和口腔区域之后；避免与感染者密切接触，尤其是在咳嗽和打喷嚏时；使用纸巾或袖子遮挡口鼻，以减少病毒传播。
2. 加强室内通风：支原体感染尤其在密闭的环境中易于传播，因此保持室内空气流通是预防感染的重要措施。
定期开窗通风，并保持空气湿度适宜，可以有效减少支原体传播的机会。
3. 避免分享个人用具：支原体可以通过污染的物品传播，因此避免与他人分享个人用具，如毛巾、梳子、化妆刷等，可以避免感染的风险。
4. 增强免疫力：免疫力强的人体对病原体的抵抗能力更强，因此保持良好的生活习惯，如合理饮食、充足睡眠、适量运动等，可以增强免疫力，降低感染风险。
此外，接种相关疫苗也是提高免疫力的重要手段，可咨询医生建议进行相关接种。
二、支原体感染的治疗方法1. 药物治疗：一旦发生支原体感染，及时使用药物治疗是关键。
支原体感染多数对抗生素敏感，因此医生会根据感染的具体情况开具相应的抗生素来治疗。
通常，选择口服抗生素进行治疗，但对于严重感染或病情进展迅速的患者，可能需要静脉注射抗生素。
2. 症状缓解：支原体感染常伴随皮肤症状，如红肿、瘙痒等。
为了缓解这些不适症状，可以使用局部抗过敏药物、外用皮肤护理品等。
但应注意，使用这类药物时应遵循医生的指导，并避免自行使用过量或长期使用。
3. 加强护理和休息：患有支原体感染的患者需要加强护理和休息，以帮助身体更好地康复。
保持充足的睡眠、饮食健康、避免劳累以及及时清洁治疗感染部位，有助于缩短病程和减轻症状。
4. 避免二次感染：支原体感染容易引起二次感染，如化脓性感染。
健康教育宣传栏关于支原体的内容
健康教育宣传栏关于支原体的内容支原体是一种微生物，可以引起多种感染性疾病。
它最常见的两种类型包括沙眼支原体和肺炎支原体，分别引起沙眼和肺炎等疾病。
支原体感染对人体健康造成了严重威胁，因此健康教育的宣传至关重要。
本文将从支原体的危害、传播途径、预防方法和治疗方案等方面进行介绍，旨在帮助公众更好地了解支原体，预防支原体感染。
一、支原体的危害支原体是一种细胞内寄生的细菌，可以引起多种感染性疾病，包括沙眼、肺炎、尿道感染等。
其中，沙眼支原体主要通过眼部粘膜感染，引起沙眼症状，包括结膜炎、角膜炎等。
肺炎支原体则主要通过呼吸道感染，引起肺炎等疾病。
支原体感染会导致炎症反应，严重时甚至会引发并发症，危害健康。
二、支原体的传播途径支原体主要通过密切接触传播，包括性接触、呼吸道飞沫传播等。
其中，沙眼支原体主要通过眼部接触传播，如眼部分泌物、手部接触等。
肺炎支原体则主要通过呼吸道飞沫传播，如咳嗽、打喷嚏等。
此外，支原体还可以通过污染的水、食物传播，给人体带来感染风险。
三、预防支原体感染为了预防支原体感染，公众需要加强健康教育，增强自我保护意识。
首先，要注意个人卫生，勤洗手、勤换洗衣物，避免眼部接触和呼吸道飞沫传播。
其次，要保持通风，避免长时间在封闭空间内，减少感染风险。
此外，要避免食用污染的水、食物，减少感染来源。
最后，要积极接受医学检查和治疗，及时进行相关疾病的预防和治疗。
四、治疗支原体感染支原体感染的治疗主要包括抗生素治疗和局部药物治疗。
对于沙眼支原体感染，可选用特效的抗生素眼药水进行局部治疗，如红霉素眼药水等。
对于肺炎支原体感染，常用大环内酯类抗生素治疗，如罗红霉素等。
同时，还可以采用抗炎、退烧、抗过敏等辅助治疗，帮助患者尽快康复。
但是，治疗前应咨询医生，严格按照医嘱用药，避免滥用和耐药性的产生。
总之，支原体是一种常见的细菌性病原体，引起多种感染性疾病。
为了预防支原体感染，公众需要提高健康保健意识，加强个人卫生，减少感染风险。
预防支原体感染的方法和措施
预防支原体感染的方法和措施支原体是一种常见的细菌引起的感染，它可以导致多种疾病，如肺炎、尿道炎和眼部感染等。
为了预防支原体感染，我们可以采取以下方法和措施。
一、保持良好的卫生习惯1. 经常洗手：使用温水和肥皂，彻底洗手，特别是在接触可能带有支原体的物体或者场景后，例如接触公共物品、咳嗽、打喷嚏后。
2. 避免用手触摸眼睛、口鼻：支原体可以通过眼睛、口鼻进入人体，所以使用纸巾或肘部遮住口鼻，不用手直接接触。
3. 定期清洁和消毒：保持环境清洁，经常擦拭常接触的物体表面，使用合适的消毒剂杀灭支原体。
二、加强个人防护1. 使用口罩：在人群密集处、公共场所、与患者接触时，佩戴医用口罩可以有效阻断支原体传播途径。
2. 使用个人防护用品：在接触支原体患者或嫌疑病例时，佩戴手套、护目镜等个人防护用品，以减少感染的风险。
三、保持良好的健康习惯和生活方式1. 均衡饮食：摄入富含维生素C、维生素E、锌等有助于增强免疫力的食物，如水果、蔬菜、坚果等。
2. 加强锻炼：适度的体育锻炼可以增强身体的免疫力和抵抗力。
3. 充足睡眠：良好的睡眠可以提升免疫系统功能，减少疾病发生的风险。
四、避免接触患者和疑似患者1. 避免去人群密集的地方：尽量减少人际接触，特别是在疫情高发地区或患者密集的场所。
2. 避免与疑似感染者接触：如果接触到疑似感染者，应戴上个人防护用品，并立即就医。
五、接种疫苗1. 支原体疫苗：根据医生建议和个人情况，接种支原体疫苗可以有效预防感染，减少患病风险。
总结起来，预防支原体感染需要我们保持良好的卫生习惯，加强个人防护，保持良好的健康习惯和生活方式，避免接触患者和疑似患者，并根据需要接种疫苗。
这些方法和措施可以有效降低感染的风险，保障个人和公众的健康。
支原体污染后的处理方法
组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。
目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。
另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。
去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，国产的很便宜，在超净台内打开，可直接往培养瓶里加，混匀，终浓度为10ug/ml，细胞连续用药两周，即OK。
也可试20，10，5，高中低三个浓度，慎重些。
本实验室多人试过，效果很好，且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，稀释量很大，能用于大量大量的细胞，经济实惠，最穷的人也用的起。
《细胞培养的微生物污染排除》一、抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。
2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。
3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。
4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。
5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。
BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。
二、加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。
三、动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。
细胞传代培养中支原体污染的来源及预防
般 预 防 可 从 以下 几 方 面 着 手 ：
① 添加抗 生素 。
② 从物 品 、用 品消毒 灭菌着 手 ：细胞培 养所用 物 品清
洗、 消毒要 彻 底 ， 种溶 液灭 菌 除菌 要仔 细 ， 在无 菌试 验 各 并 呈 阴性后才 能使用 。 操作 室及剩余 的无菌 器材要定期 清洁 、
研 究结 果造成严 重影 响 。为 了保证 细胞体 系免受 污染 的影
响 。 可能减 少污染 的发生 及危 害产生 的关键 是加 强预防 。 尽
一
不 易看 清 内部 结 构 ，电 镜 下 观 察 支 原体 膜 为 ３层 结 构 。 支 原体 多 吸 附或 散 在 于细 胞 表 面和 细 胞 之间 。横 断 面 与
台使用过 久 ， 滤板未 定期 更换或 长 久不更换 ， 气受 尘埃堵 滤
塞 ， 丁作 时 不 带 口罩 或 外 界 气 流 过 强 。污 染 空 气 进 入 操 作 区 ， 会 导 致 污 染 。 夏 季 南 方 地 区 多 雨 ， 气 湿 度 大 ， 菌 也 春 空 含 量 多 ， 作 不 注 意 也 易造 成 污 染 。 丁 ２２ 清 洗 消 毒 ．
是 加强预 防措施 。
关键 词 ： 胞培 养 ； 细 支原 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ； 染 ； 污 预防
中 图分 类号 ： ３５ Ｑ ５ Ｒ ７ ； ２
文 献标 识 码 ： Ｂ
原体 。
文 章顺 序 编 号 ：６２ ５ ９ （０ ９ ０ － ０９ ０ １７ － ｔ０ ２ ０ ）１０ ４ — １
污 染 是 细 胞 培 养 技 术 中 面 临 的 主 要 问 题 ， 特 别 是 传 代 细 胞 被 支 原 体 污 染 是 个 世 界 性 难 题 。 在 细 胞 培 养 中支原体感 染发生率 达到 ６ ３％ ， 原 体 感 染 发 生 后 能 支 改 变 细 胞 的 Ｄ Ａ、 Ｎ 及 蛋 白 表 达 ， 培 养 液 不 发 生 混 Ｎ Ｒ Ａ 但 浊 ． 胞 一 般 也 无 明 显 变 化 。笔 者 通 过 支 原 体 的 来 源 、 细
细胞支原体污染
细胞支原体污染较长一段时间，一直觉得细胞培养有点问题，无缘无故的出现细胞代谢异常现象，培养基内小渣渣变多，看不到细菌污染，看不到培养基浑浊，但可以感觉到细胞状态不行，即使是单层没有复层时也一样，当时考虑支原体污染，查了一些有关支原体污染的内容，由于细胞状态可以在换新鲜培养基的时候转变过来，而自己的实验也是需要在换培养基后进行，故而疏忽了可恶的支原体污染，今天决定解决这个问题。
先查了一下资料：细胞支原体污染的一般情况及预防措施细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。
而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。
但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：国家受支原体污染(%) 报告年度USA－FDA 15 1993(past 30 years)USA－ATCC 15-20 1992Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998Germany－DSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因：1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5、研究或操作人员忽略污染问题支原体污染的来源：1、已受污染的细胞2、操作人员的疏失3、已受污染的培养基、血清4、操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。
而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。
细胞培养时遇到支原体污染怎么办
细胞培养时遇到支原体污染怎么办前言：细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。
目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。
目前已知的主要污染源是动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶，例如，猪鼻支原体通过胰酶，在消化细胞时进入细胞培养物，并造成污染。
在原代细胞与传代细胞的检测中，原代细胞与传代细胞分离出支原体的频率是有明显差异的，传代次数越多的细胞，污染支原体的可能性就越大，这也是多次与动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶接触后造成的，在原代细胞中，污染率低于4%，而传代细胞的污染率则高达57%~92%。
支原体的介绍支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。
支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。
大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。
对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。
细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
细胞受支原体污染严重（1）据统计世界范围内大约有15%-35%的细胞培养物遭受了支原体污染。
（2）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
（3）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
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细胞支原体污染一般情况及预防措施
细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。
而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。
但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：
国家受支原体污染(%) 报告年度
USA－FDA 15 1993(past 30 years)
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 8
Germany－DSM 36 1990-1994
Argentina 65 1987
Israel 32 1986-1993
China 95 1990
造成支原体高污染率的原因为：
1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
5、研究或操作人员忽略污染问题
支原体污染了来源：
1、已受污染的细胞
2、操作人员的疏失
3、已受污染的培养基、血清
4、操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。
而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。
但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（B ayer），Enrofloxacin（Bayer）
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3、Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
设备方面：
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染之问题与回答：
1、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
3、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
支原体之检测：
直接培养法
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。
有些支原体不能在培养基培养出来(例如M. hyorhinis)。
需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast ext ract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L -玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。
）
培养基制备：
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock sol ution (10%)。
由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
·10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。
以0. 22μm无菌过滤膜过滤灭菌。
分装100 ml至瓶中，保存于-70℃。
·液体培养基(1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。
灭菌121℃，15分钟。
待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml
之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。
保存于4℃，期限1个月。
·固体培养基(1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600 ml蒸馏水中，加热溶解之。
灭菌121℃，15分钟。
放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。
保存于4℃，期限1个月。
步骤：
·取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。
培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
·另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
·另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。
负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读：
·支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。
需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。
所以整个测试需5个星期才知正确结果。
·典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。
但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
·若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。