分子杂交技术PPT讲稿
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核酸分子杂交课件
探针标记
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
杂交技术 PPT课件
12
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
13
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
18
尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
19
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
21
c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
13
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
18
尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
19
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
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c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
ppt课件
27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸的分子杂交1310PPT课件
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23
重物 支持平台
玻璃板
吸水纸
湿滤纸 膜 胶 湿滤纸 湿滤纸桥
20×SSC
毛细管虹吸法Southern转膜示意图
.
玻璃容器 24
5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法
制备探针、标记。
6. Southern杂交
（1） 预杂交 封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时
⑵ 液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放
在液体中进行杂交反应。
两种杂交形式的基本原理都是一样的。
从发展历史来看,先有液相杂交,后有固—液相杂交.
.
13
四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性
1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸
碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断
裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、
如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核
酸分子。
除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主
要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而
AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.
.
16
2.复性
DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分
（2） 杂交 （过夜）
7. 杂交结果的检测
（1） 放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；
（2） 非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。
.
25
②
③ ①
分子杂交实验过程 .
目录
26
பைடு நூலகம் 射 自 显 影 照 片
第九章分子杂交技术1ppt课件
不易核酸电转
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
Northern 印迹杂交
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同
靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
核酸分子杂交的原理
第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
探针的分类 主
要 探针的标记
内
容 标记物
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
WESTERN BLOTTING
其基本过程为：
（1）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳。 （2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。 （3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。
（4）显色。
本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏 特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的 抗原。
转膜
HRP 2Ab
随机引物延伸（random primer)
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
Northern 印迹杂交
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同
靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
核酸分子杂交的原理
第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
探针的分类 主
要 探针的标记
内
容 标记物
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
WESTERN BLOTTING
其基本过程为：
（1）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳。 （2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。 （3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。
（4）显色。
本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏 特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的 抗原。
转膜
HRP 2Ab
随机引物延伸（random primer)
基因探针分子杂交技术ppt课件
• 对于因为基因内点突变或基因部分缺失、
重排或插入而引起的遗传性疾病,可以用 DNA探针进行Southern印渍杂交直接加以 分析诊断。 • 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传 性疾病,则需要用DNA探针技术分析限制 性片段长度多态性,以此作为遗传标志作 出分析诊断。 • 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断 或遗传咨询、携带者普查,为防治遗传性
• 二、探针的标记
同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光 素等
xx
地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
• 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定
的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空 白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止 在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是 碱变性，而是采用化学试剂变性法。 • 3、主要用于检测某一组织或细胞中已 知的特异mRNA的表达水平，或比较不同 组织或细胞的同一基因的表达情况。
xx
Western杂交 • 1、基本原理和基本过程与
Southern杂交基本相同 • 2、检测对象为蛋白质（或酶） • 3、SDS-PAGE 电泳分离 • 4、用“抗体-抗原”免疫反应或 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
Molecular probe techniques
基因探针 ——分子杂 交技术
目录
• 简介 •操作步骤 基本原理 • 分类 Southern杂交
Northern杂交 Western 杂交
xx
基因探针
• 基因探针，即核酸探针，是一段带有检
测标记，且序列已知的，与目的基因互 补的核酸序列(DNA或RNA)。
重排或插入而引起的遗传性疾病,可以用 DNA探针进行Southern印渍杂交直接加以 分析诊断。 • 对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传 性疾病,则需要用DNA探针技术分析限制 性片段长度多态性,以此作为遗传标志作 出分析诊断。 • 总之,DNA探针技术有助于开展产前诊断 或遗传咨询、携带者普查,为防治遗传性
• 二、探针的标记
同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光 素等
xx
地高辛：
可以与dCTP连接成地 高辛-dCTP
原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）
杂交
• 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定
的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空 白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止 在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
要限制性核酸酶切；2）变性方法不是 碱变性，而是采用化学试剂变性法。 • 3、主要用于检测某一组织或细胞中已 知的特异mRNA的表达水平，或比较不同 组织或细胞的同一基因的表达情况。
xx
Western杂交 • 1、基本原理和基本过程与
Southern杂交基本相同 • 2、检测对象为蛋白质（或酶） • 3、SDS-PAGE 电泳分离 • 4、用“抗体-抗原”免疫反应或 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 上的蛋白质。
Molecular probe techniques
基因探针 ——分子杂 交技术
目录
• 简介 •操作步骤 基本原理 • 分类 Southern杂交
Northern杂交 Western 杂交
xx
基因探针
• 基因探针，即核酸探针，是一段带有检
测标记，且序列已知的，与目的基因互 补的核酸序列(DNA或RNA)。
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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第八章 分子杂交技术ppt课件
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44
1、鉴别RNA 2、探针可用DNA或RNA片段 3、待测样品为总RNA或mRNA
.
45
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1. 总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式 存在，可直接应用于电泳；
2、变性：RNA电泳前加热变性，电泳在变性条件下进行, 以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟 甲基汞变性电泳。DNA电泳前和电泳 中不变性
杂交过夜（至少18h），然后在较高温度下用盐溶液洗膜。
.
39
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特 异结合的DNA
在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射 性检测仪探测膜上的放射强度。当放射 强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即 停止洗膜。
洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用
滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包
完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此
之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同
源性）就可以形成杂交双链
.
2
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
.
28
（1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
自学内容2分子杂交技术
可编辑ppt
6
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段；
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置， 确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片 段dization & Blotting Technology
可编辑ppt
1
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂交双链(heteroduplex) 。
4
二、印渍技术的类别及应用
• DNA印迹技术 Southern blotting
• RNA印迹技术 Northern blotting
• 蛋白质印迹技术 Western blotting
• 斑点印迹
Dot blotting
• 原位杂交
in situ hybridization
• DNA点阵
DNA array
• 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血
清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
• 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备 – 聚丙烯酰胺凝胶
– 蛋白质的电转移：尼龙膜 – 靶蛋白的免疫学检测
• 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 • 显色反应：酶促反应
第一节 核酸分子杂交-PPT
第二十章常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniquesin Molecular Biology掌握：1.分子杂交技术的概念及基本原理2.Southern、Northern、Western印迹法的适用范围。
3.聚合酶链式反应的概念及基本原理4.了解基本概念学习要求学习要求第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术核酸的分子杂交：碱基序列互补的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。
以DNA的变性和复性为理论基础复性RNA DNA•将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。
•硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC 膜)探针(probe)的概念用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的已知被标记的DNA片段或RNA片段探针的种类o寡核苷酸探针o基因组DNA探针o cDNA探针o RNA探针•常用探针标记方法：1.放射性核素标记(放射自显影）2.生物素标记（酶联反应-显色）3.地高辛标记（酶联反应-显色）4.分子信标（荧光）第一节 分子杂交技术 – 应用1.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质（一）Southern blottingl1975年，英国Edwen Southern创建l检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
l原始文献出处：Southern EM. Detection ofspecific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.（一）Southern blotting10×SSC转移缓冲液Whatman 滤纸凝胶Whatman 滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g与探针同源杂交的基因组DNA DNA 酶切片段内切酶NC 膜或尼龙膜Southern转膜---如何转膜？•常用方法：毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法电转印法Southert blotting用途•1、酶切图谱分析•2、特定基因定性和定量•3、基因突变分析•4、限制性片段长度多态性的分析（二）RNA 印迹技术(Northern blotting)相同点：Alwine JC , et al . Method for detection of specific RNA s in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处名称相对于Southern blotting•转移的是RNA •转移前无需酶切•转移效率较高•变性方法不同点原理均为毛细作用。
食品安全快速检测技术7分子杂交技术PPT课件
I
1 0 %S D S
5 '
I I
5 '
I I I
5 '
I V
8 0 ℃ 真 空 干 燥
0 . 5 NN a O H
1 MT r i sp H 7 . 4 1 . 5 MN a C l + 0 . 5 MT r i sp H 7 . 4
三、
杂交样品膜的制备
i) 细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百 个以下） ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移—用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同）
一. 分子杂交种类
2）斑点杂交(dot hybridization)
先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进 行杂交，放射自显影后，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因 缺失或拷贝数改变的检测，半定量分析。
3）印迹转移杂交(blotting hybridization)
先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基 质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方 法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法。 根据转移对象的不同分为 Southern 印记法（ DNA ）、 Northern 印迹法 （RNA）和Western 印迹法（蛋白质）。
食品安全快速 检测技术7分 子杂交技术
分子杂交技术
分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生 物分子的一门技术。 样 分 电 转 品 子 泳 膜 杂 制
交 流 程 图
备
分子生物学常用技术杂交 ppt课件
• 探针的制备 • Southern杂交 • 杂交结果的检测
PPT课件 26
PPT课件
27
Southern转膜变性杂交:
1．DNA的变性解链: 数倍体积的1.5mol/L 中1小时 NaCl和0.5mol/L NaOH
2. 中和: 然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和 1.5mol/L NaCl溶液中和1小时 3．转移: 变性DNA在硝酸纤维素膜, 尼龙膜上的固定。硝酸纤维 素滤膜（孔径0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA样品转移或加至硝 酸纤维素膜上后，然后再在80℃真空干燥2h or UV cross link。 4．预杂交: 预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS， 5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切 和DNA酶消化处理，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮 沸变性10min，
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11
3、RNA探针：
RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于 RNA 是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高 , 特异性强。
克隆载体体外转录(in vitro transcription)
RNA探针 容易降解
PPT课件
12
4、寡核苷酸探针：
根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的 寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据 蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼 并性。多用于克隆筛选和点突变分析。
来源:
分子克隆 RT- PCR
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DNA探针（包括cDNA探针）的优点：
①: 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限 繁殖、大量制备、方法简便。 ②: 不易降解（相对RNA而言），DNA酶活性一 般能有效抑制。 ③: DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可 供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位 素和非同位素标记。
《分子杂交技术hu》PPT课件
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3
第一节 分子杂交
1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 1.2 斑点杂交（dot blotting） 1.4 Northern hybridization 1.5 Western blotting 1.6 电镜观察
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4
1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 原位分子杂交有两种: ➢玻片原位杂交 ➢膜上原位杂交
✓ 用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜， 然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。
✓ 在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性 与结合的探针量呈正比。
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5
①玻片原位杂交
• 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等;
• 片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性， 然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充 分洗脱；
• 若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或 复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然 后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的 相对位置。
• R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行杂 交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的双链 比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换了出 来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。
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12
第二节 核酸杂交简史与原理
2.1 核酸杂交技术简史 2.2 核酸杂交原理
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9
1.4 Northern hybridization
• Northern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓 “Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己 的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。
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分子杂交技术课件
第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下
按碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键 （主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此 之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同 源性）就可以形成杂交双链
（1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
• 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交
• 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
一、Southern杂交
• 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相
载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
• 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，
直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交 去除未参与杂交的探针
加入标记核酸探针
检测杂交信号
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交 →洗涤→放射自显影或显色反应。
三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
再 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
• 如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
成双链：
• DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡
核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链
重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中 心序列
（4）形成完整的双链分子
二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达 1.5kb。制备方法：
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
(1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针
合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
• DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤
膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
• 利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图
谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、 基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。
步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然
等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
• （二）复性
•
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双链
核酸的过程，称复性或杂交。
• 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜Βιβλιοθήκη 吸附有DNA 片段的膜杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子 量DNA也能显影出条带。
后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 细胞总DNA 细胞总RNA
提纯的 细胞内杂交（细胞原位杂交）
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使 用的探针已知序列进行特异性的靶序列 检测。
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链
间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
• 2、变性的方法： • （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双
链核酸 分子链间的氢键完全断裂。
• （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双
链核酸分子链 间的氢键断裂。
• （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛
8个以上碱基序列相同，最好不用。
3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的 信号。
标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
第二节 核酸分子杂交的方法
• 按其分子种类划分
第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下
按碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键 （主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此 之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同 源性）就可以形成杂交双链
（1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
• 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交
• 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
一、Southern杂交
• 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相
载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
• 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，
直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交 去除未参与杂交的探针
加入标记核酸探针
检测杂交信号
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交 →洗涤→放射自显影或显色反应。
三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
再 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
• 如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
成双链：
• DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡
核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链
重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中 心序列
（4）形成完整的双链分子
二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达 1.5kb。制备方法：
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
(1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针
合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
• DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤
膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
• 利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图
谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、 基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。
步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然
等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
• （二）复性
•
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双链
核酸的过程，称复性或杂交。
• 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜Βιβλιοθήκη 吸附有DNA 片段的膜杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子 量DNA也能显影出条带。
后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 细胞总DNA 细胞总RNA
提纯的 细胞内杂交（细胞原位杂交）
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使 用的探针已知序列进行特异性的靶序列 检测。
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链
间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
• 2、变性的方法： • （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双
链核酸 分子链间的氢键完全断裂。
• （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双
链核酸分子链 间的氢键断裂。
• （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛
8个以上碱基序列相同，最好不用。
3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的 信号。
标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
第二节 核酸分子杂交的方法
• 按其分子种类划分