具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的蛇足石杉内生真菌分子鉴定_赖政

菌物学报
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15 July 2014, 33(4): 858‐866 Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.
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Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province, Jiangxi Normal University,
Nanchang, Jiangxi 330022, China
参考 Ellman et al（ . 1961） 和汪涯等 （2011a） 的方法测具内生真菌菌体和发酵液中总生物碱 的 AChE 抑制活性，以 HupA 为阳性对照。在 EP 管中加入菌体总生物碱样品、发酵液总生物碱 样品或 HupA 40L、30L 0.22U/mL AChE、30L 15mmol/L ATCI，磷酸缓冲液补平体系至终体积 为 190L，混合 37℃温浴 30min，加 10L 4%十 二烷基硫酸钠室温下终止反应 20min，移入 96 孔板上，加显色剂 125L 3mmol/L DTNB 显色 5min，412nm 处酶标仪检测，以下列公式计算 总生物碱对 AChE 的抑制率 I（%） ：
赖 赖等/ 具 具 乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 活 性 的 蛇 足 石 杉 内 生 真 菌 分 具 具 具
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(PDB), sabouraud dextrose broth (SDB) and cazpek dextrose broth (CDB) liquid medium and the acetylcholinesterase‐ inhibitory activity of total alkaloid was analyzed. It was indicated that the inhibition rate of total alkaloid extracted from the strains SF88 and LF52 mycelium in PDB, SDB and CDB medium against acetylcholinesterase was 45.6% and 56.7%, 56.3% and 68.5%, 40.8% and 48.3%, respectively. rDNA ITS, 18S rDNA, 28S rDNA, TUB and RPB sequence analyses showed that the endophytic fungus strains belong to an unknown species in the family Phaeosphaeriaceae and SF88 and LF52 could be provided as the new potential resources for producing acetylcholinesterase‐inhibitor. Key words: Huperzia serrata, Phaeosphaeriaceae, phylogenitic analysis
摘 要：在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB） 、沙氏液体培养基（SDB）和查氏液体培养基（CDB）中发酵培养蛇足 石杉内生真菌菌株 SF88 和 LF52，乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性检测结果表明，菌株 SF88 和 LF52 在 PDB、SDB 和 CDB 发酵后菌体总生物碱对 AChE 活性的抑制率分别为 45.6%和 56.7%、56.3%和 68.5%、40.8%和 48.3%。对这两 株不产孢内生真菌的 DNA ITS、18S rDNA、28S rDNA、TUB 和 RPB 进行了测序，系统发育分析表明，SF88 和 LF52 为 Phaeosphaeriaceae 科中一未知种，为开发生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）药物提供了新的潜在菌种资源。 关键词：蛇足石杉，暗球腔菌科，系统发育分析
研 研 研 研Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.130226
具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的蛇足石杉内生真菌分子鉴定
赖政 1∆
1 2 3
汪娣 1∆
汪涯 2, 3
颜日明 1
张志斌 1
高波良 1
朱笃 1, 2*
江西师范大学 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 江西 南昌 330022 江西科技师范大学生命科学学院 江西省生物加工过程重点实验室 江西 南昌 330013 宜春学院 江西 宜春 336000
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Key Lab of Bioprocess Engineering of Jiangxi Province, College of Life Sciences, Jiangxi Science and Technology Normal
University, Nanchang, Jiangxi 330013, China
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株：供试内生真菌菌株 SF88 和 LF52 分 离自江西庐山野生蛇足石杉，现保藏于江西师
菌物学报
860 ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema July 15, 2014 Vol. 33 No. 4
范大学江西省亚热带植物资源保护与利用重点 实验室。 1.1.2 培养基： 内生真菌活化培养采用马铃薯葡 萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA） ； 液体发酵培养采用沙氏液体培养基（sabouraud dextrose broth，SDB） 、马铃薯葡萄糖液体培养 基（potato dextrose broth，PDB）和查氏液体培 养基（cazpek dextrose broth，CDB） 。 1.1.3 主 要 试 剂 和 仪 器 ： 碘 化 硫 代 乙 酰 胆 碱 （acetylthiocholine iodide， ATCI） 、 5,5‐二硫代‐2‐ 硝基苯甲酸（dithiobis‐nitrobenzoic acid，DTNB） 和 AChE 标准品均购自 Sigma 公司；PTC‐200 型 PCR 仪（美国 MJ Research 公司） ；电泳仪及电 泳槽（北京六一厂） ；凝胶成像系统（美国 UVP 公司） ；多功能酶标仪（美国 Bio‐Rad 公司） 。 1.2 内生真菌菌体和发酵液中总生物碱的提取 及 AChE 抑制活性检测 将内生真菌菌株 SF88、LF52 的菌丝分别接 种于 SDB、PDB 和 CDB 培养基中，500mL 三角 瓶装液量 100mL， （28±1）℃、120r/min 摇瓶培 养 14d； 5 000r/min 离心 20min 分别收集菌丝体 和发酵液。菌体 40℃烘干 2d 后干燥粉碎、发 酵液浓缩后用 1%盐酸水溶液提取数次， 酸水减 压浓缩后加入浓氨水碱化到 pH9–10，再用氯仿 反复萃取 3 次，氯仿萃取液减压浓缩成生物碱 粗品，用 2mL 无菌水 45℃温浸，充分混匀制成 总生物碱样品，4℃保存待用。
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Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China
Abstract: Two endophytic fungus strains, SF88 and LF52, from Huperzia serrata were cultured in potato dextrose broth
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
蛇足石杉 Huperzia serrata (Thunb.) Trev. 为石杉科石杉属药用蕨类植物，民间用其全草 治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、淤血肿痛和精神分 裂等疾病，活性成分石杉碱甲（ huperzine A， HupA）是一种可逆、高效的选择性生物碱类乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂 （ acetylcholinesterase Inhibiters，AChEI），对提高记忆力和治疗早期 老年痴呆 具 显著疗效（洪思佳等 2007；张君诚 等 2008）。具 于植物内生真菌能与宿主协同进 化，可产生与宿主相同或相似的 具 具 生物活性 的代谢产物（ Stierle et al. 1993），我们从野生 蛇足石杉中分离筛选获得 39 株产 HupA 等 具 具 AChEI 活性的内生真菌（ Zhu et al. 2010；汪涯 等 2011a， 2011b； Zhang et al. 2011； Wang et al. 2011）的基础上，最近又发现，蛇足石杉内生 真菌 SF88 和 LF52 液体发酵后的菌体内总生物 碱均 具 具 乙酰胆碱酯酶（ acetylcholinesterase， AChE）抑制活性，但在多种培养基上和不同诱 孢条件下均未观察到其产孢结构，本研 研 采用 多段分 具 序列分析（ rDNA ITS、18S rDNA、28S rDNA、TUB 和 RPB 序列）方法，对蛇足石杉内 生真菌菌株 SF88 和 LF52 进行了 具 具。
基金项目：国家自然科学基金（No. 21066014，No. 81260617，No. 31300051） ；国家“十二五”科技支撑项目（No. 2011BAC13B04） ； “赣鄱英才 555 工程”领军人才计划；江西省重大科技专项（No. 2010AZD00307） ；江西省教育厅 科学技术研研项目（No. GJJ14595） ；江西省研研生创新基金（No. YC2013‐S106） ；江西省亚热带植物资源保护与利 用重点实验室开发基金（No. YRD201306，No. YRD201401） ∆ 并列第一作者 * Corresponding author. E‐mail: zhudu12@163.com 收稿日期: 2013‐11‐09, 接受日期: 2014‐02‐24
Molecular identification of endophytic fungi with inhibitory activity against acetylcholinesterase from Huperzia serrata
LAI Zheng1∆ WANG Di1∆ WANG Ya2, 3 YAN Ri‐Ming1 ZHANG Zhi‐Bin1 GAO Bo‐Liang1 ZHU Du1, 2*
I OD对照组 – OD实验组 OD对照组 × 100%
检测后送交上海生工生物工程技术服务具 限公 司测序。 1.3.2 系统发育分析： 将测得的序列在 NCBI 数 据库中进行 BLAST 比对并申请 GenBank 登录 号，下载相关菌株的 rDNA ITS 、 18S rDNA 、 28S rDNA、 TUB 和 RPB 序列。采用 MEGA 4.0 软 件 Clustal X 方 法 进 行 系 统 发 育 分 析 ， 以 Neighbour‐joining 法 构 建 菌 株 rDNA ITS 、 18S rDNA、 28S rDNA、 TUB 和 RPB 序列系统进 化树。以在分枝上标记 1 000 次重复获得的自 展检验 Bootstrap 值，以评估系统发育树的置 信度，从而确具菌株的亲缘关系及分类地位。 使用 MEGA4.0 软件中的 Pairwise‐distance 来确 具菌株的相关性。